謝勇 林中景 葛莉 龐書勤 蔡靜雯

流行病學資料顯示，2型糖尿病患病人數(shù)正在全世界范圍內(nèi)呈逐步上升趨勢，病人總數(shù)高達1億以上，而中國已成為世界第一糖尿病大國?，F(xiàn)代研究認為，2型糖尿病屬于常見的慢性綜合性疾病，治療藥物往往難以避免地會對人體造成一些副作用。如控制不當，2型糖尿病可能發(fā)展并常伴有肝腎功能損害、白內(nèi)障等眼病、心腦血管疾病等并發(fā)癥。由于2型糖尿病患者糖脂代謝紊亂，體內(nèi)自由基生成增加、清除能力受損，并發(fā)癥的發(fā)生與體內(nèi)抗氧化能力與自由基之間的失衡密切相關，因此，尋求一種既能降低血糖、血脂又兼有抗氧化作用的膳食療法，對2型糖尿病并發(fā)癥的預防顯得十分重要。

薯蕷粥是藥膳中的經(jīng)典食療方，出自清代張錫純的《醫(yī)學衷中參西錄》，“治陰虛勞熱，或喘，或嗽，或大便滑瀉，小便不利，一切羸弱虛損之證?！笔硎氈嗟氖巢氖巧鷳焉剿?，山藥具有滋陰清熱、益氣健脾、益胃補腎的功效，對糖尿病患者能夠發(fā)揮標本兼治、益氣養(yǎng)陰、調(diào)節(jié)臟腑氣血陰陽的作用，從而預防糖尿病性中風的發(fā)生。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，懷山藥多糖具有明顯的降血糖作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，懷山藥在一定程度上還能降低血清脂質(zhì)和總膽固醇的水平，預防血管的脂肪沉積，保持血管的彈性，防止動脈粥樣硬化過早發(fā)生，保護糖尿病患者的微血管。

人體腸道擁有超過1000種微生物，腸道菌群也有“新器官”的稱謂，其結構或分布的改變直接影響人體健康。研究表明，2型糖尿病患者腸道菌群的表現(xiàn)有一定差異，患者體內(nèi)厚壁菌門（Firmicutes）與擬桿菌門（Bacteroidetes）兩者比值相對升高。這充分說明腸道菌群和糖尿病有著緊密的聯(lián)系，可以考慮通過控制菌群數(shù)量的變化來改善人體健康狀況。例如，調(diào)控擬桿菌、雙歧桿菌、柔嫩梭菌和乳桿菌的變化，或?qū)⒊蔀檎{(diào)理糖尿病的新醫(yī)學靶點；透過腸道菌群與糖尿病的關系，更清晰地研究微生物的結構和功能及其影響人體慢性疾病的機理。

本研究通過建立動物模型，從薯蕷粥調(diào)控腸道菌群的角度出發(fā)，旨在探究薯蕷粥對2型糖尿病小鼠腸道微生物多樣性的影響，為薯蕷粥調(diào)控2型糖尿病的作用提供新的研究視角與思路。

一、實驗材料

1.薯蕷粥。將新鮮懷山藥按經(jīng)典方《醫(yī)學衷中參西錄》制成薯蕷粥，經(jīng)真空冷凍干燥后得到薯蕷粉末，按照不同劑量設置加入不同克數(shù)的薯蕷粉末并溶于一定量的水，攪拌溶解后放至冰箱冷藏保存。

2.實驗試劑。鹽酸二甲雙胍片，北京京豐制藥集團有限公司；鏈脲佐菌素（STZ），上海麥克林；檸檬酸鈉（食品級）和無水檸檬酸（食品級），濰坊英軒實業(yè)有限公司。

3.高脂飼料。高脂飼料（D12492）由廣東省醫(yī)學實驗動物中心加工提供，配方組成包括酪蛋白、玉米淀粉、蔗糖、麥芽糖糊精、纖維素、豆油、氯化鈉、維生素、氨基酸和礦物質(zhì)等。飼料成分：膽固醇為300.8mg/kg，碳水化合物質(zhì)量比為26.3%，脂肪質(zhì)量比為34.9%。

4.實驗動物。昆明（KM）種小鼠70只，雄性，體重范圍18-22g，清潔級，購自福建省福州市吳氏動物中心；動物飼養(yǎng)溫度為20-25℃；實驗過程中對動物的處理符合動物倫理學的標準。

二、實驗方法

1.制備受試樣品溶液。（1）配制薯蕷粥受試樣品溶液。本實驗薯蕷粥受試樣品溶液設置為低、中、高3個劑量組。低劑量組準確稱取4.5g薯蕷粉末溶于50mL蒸餾水，設置給藥濃度為1.125g/kg；中劑量組準確稱取9g薯蕷粉末溶于50mL蒸餾水，設置給藥濃度為2.25g/kg；高劑量組準確稱取13.5g薯蕷粉末溶于50mL蒸餾水，設置給藥濃度為3.375g/kg。將樣品溶液攪拌均勻后倒入血清瓶中，放入冰箱冷藏留待使用，使用前加熱搖勻，各劑量組每日灌胃量均為0.5mL。（2）陽性對照樣品的配制。精確稱取0.5g鹽酸二甲雙胍片，研磨搗碎加入燒杯中，加入100mL蒸餾水攪拌至溶解完全，即可獲得濃度為0.06g/kg的陽性樣品。蓋上保鮮膜常溫保存，使用前攪拌均勻。（3）鏈脲佐菌素（STZ）溶液的配制。取0.58g檸檬酸溶于30mL蒸餾水中配置成A液，取0.88g檸檬酸鈉溶于30mL蒸餾水中配置成B液，將A、B兩種溶液混合，通過藍色石蕊試紙測量溶液pH值，調(diào)節(jié)pH值在4.4左右，即為所需鏈脲佐菌素緩沖溶液。稱量0.255gSTZ，用23mL鏈脲佐菌素緩沖溶液溶解，即制成138.6mg/kg的鏈脲佐菌素溶液，要求在30分鐘內(nèi)注射完畢，避免失活。

2.糖尿病模型鼠建立及分組給藥。從70只雄性小鼠中隨機選取10只小鼠記作空白組，自由飲食飲水，采用正常基礎飼料。剩下60只用小鼠用高脂飼料連續(xù)飼養(yǎng)4周之后，禁食不禁水約12h，通過腹腔注射的方式注射一定濃度的STZ溶液，誘導建立2型糖尿病模型。3天后，觀察小鼠毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)、飲食和尿量，進行尾尖剪尾取血，采用羅氏血糖儀進行測量，如隨機血糖平均值大于11mmolL-1時，則認定為造模成功。隨機分配造模成功小鼠，設置空白組、模型組、二甲雙胍組和薯蕷粥組（低、中、高劑量），每組10只，分盒分開進行飼養(yǎng)。空白組和模型組小鼠每日灌胃0.5mL蒸餾水，二甲雙胍組小鼠每日灌胃0.5mL鹽酸二甲雙胍溶液，薯蕷粥各組每日灌胃0.5mL配置好的不同劑量的薯蕷粥溶液，約4周后測量空腹血糖水平并收集糞便樣品。

3.觀測指標及檢測方法。（1）小鼠血糖水平的測定。在實驗結束取材前的兩周，測量小鼠空腹血糖及體重，小鼠12h禁食不禁水，剪去尾尖血管取血，通過羅氏活力血糖儀進行測量和記錄。（2）小鼠糞便腸道菌群檢測。實驗結束后收取小鼠新鮮糞便，置于無菌離心管并在-80°C低溫保存。提取微生物組總DNA序列，采用Nanodrop對DNA進行定量，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。以能夠反映菌群組成和多樣性的目標序列為靶點，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設計相應引物，基于16SrRNA對V3V4可變區(qū)進行檢測并采取PCR擴增，PCR時所用引物序列如下：

三、實驗結果

1.薯蕷粥對T2DM小鼠血糖的影響。實驗結束后將各組小鼠的空腹血糖值進行比較。與空白組相比較，模型組小鼠的空腹血糖顯著升高（P<0.05）；與模型組相比較，鹽酸二甲雙胍組小鼠空腹血糖顯著降低（P<0.05），薯蕷粥低劑量組（P<0.01）及薯蕷粥中劑量組（P<0.05）小鼠空腹血糖顯著降低。（詳見圖1）

2.微生物群落結構分析。將數(shù)據(jù)在細菌菌門、菌綱、菌屬水平下進行匯總，并計算這三個分類水平下的細菌豐度。

（1）菌門水平分析（樣品Phylum分類水平中物種分析）。從圖2可以看出，所有樣品80%以上的腸道菌群都為厚壁菌門Firmicutes和擬桿菌門Bacteroidets；其余被檢測到的主要菌門還有變形菌門Proteobacteria、放線菌門Actinobacteria等，共約占3.9%-19.7%。與空白組相比較，模型組的厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值相對升高，擬桿菌門Bacteroidets相對豐度降低，厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria豐度增加。與模型組相比較，二甲雙胍組以及薯蕷粥低、中、高劑量組的厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值下降，厚壁菌門Firmicute相對豐度均減少，變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria豐度均增加。

A.空白組；B.模型組；C.陽性對照組；D.低劑量組；E.中劑量組；F.高劑量組

（2）菌綱水平分析（樣品Class分類水平中物種分析）。從圖3可以看出，所有樣品50%以上腸道菌群都為擬桿菌綱Bacteroidia和梭菌綱Clostridia；其余被檢測到的主要菌綱還有芽孢桿菌綱Bacilli、γ-變形菌綱Gammaproteobacteria等，共約占11.2%-45.6%。與空白組相比較，模型組的擬桿菌綱Bacteroidia和芽孢桿菌綱Bacilli相對豐度減少，梭菌綱Clostridia豐度增加。與模型組相比，二甲雙胍組及薯蕷粥各劑量組的γ-變形菌綱Gammaproteobacteria和梭菌綱Clostridia相對豐度減少。

A.空白組；B.模型組；C.陽性對照組；D.低劑量組；E.中劑量組組；F.高劑量組

（3）菌屬水平分析（樣品Genus分類水平中物種分析）。從圖4可以看出，樣品中多數(shù)以擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus 、普雷沃菌屬Prevotella和顫螺菌屬Oscillospira為主，其余還有支原體屬Allobaculum、嗜冷桿菌屬Psychrobacter等。與空白組相比，模型組的擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus、普雷沃菌屬Prevotella、顫螺菌屬Oscillospira和瘤胃球菌屬Ruminococcus豐度增加。與模型組相比，二甲雙胍組及薯蕷粥各劑量組的顫螺菌屬Oscillospira、普雷沃菌屬Prevotella和瘤胃球菌屬Ruminococcus相對豐度降低，薯蕷粥低、高劑量組的乳桿菌屬Lactobacillus豐度均增加。

A.空白組；B.模型組；C.陽性對照組；D.低劑量組；E.中劑量組組；F.高劑量組

四、討論

山藥的主要化學成分包括多糖、氨基酸、脂肪酸、淀粉等，具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)脾胃等藥理作用。本研究從腸道菌群調(diào)節(jié)角度，進一步闡述山藥的降糖功效及菌群機制。

腸道菌群是攜帶人體“第二基因”的“隱形器官”，菌群改變可引起胰島素抵抗、炎癥、血管疾病和代謝紊亂，從而介導代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展。胰島素抵抗的發(fā)生起源于腸道菌群紊亂，因此明晰菌群的分布、組成及其特點，或可為2型糖尿病的飲食干預提供新的思考角度。研究表明，柔嫩梭菌屬、乳酸菌屬、雙歧桿菌屬和血糖代謝有緊密聯(lián)系。其中，柔嫩梭菌屬具有調(diào)節(jié)代謝、抵抗炎癥的功能；雙歧桿菌屬和乳酸桿菌屬是人體腸道內(nèi)重要的有益菌，為維持腸道微生態(tài)的動態(tài)平衡做出貢獻。

2型糖尿病患者的厚壁菌門與擬桿菌門的比值上升等一系列實驗結果揭示了機體與腸道菌群的關系，在健康和疾病中的重要作用被不斷發(fā)掘。本實驗通過對2型糖尿病模型血糖和腸道菌群實驗指標的檢測，系統(tǒng)分析上述指標是否具有顯著差異。通過腸道菌群多樣性分析得出，薯蕷粥低劑量組的菌群豐度及多樣性相比模型組均有所增加。小鼠糞便樣本中主要的菌群為厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidets），兩者之和占80%以上。

與空白組比較，模型組的空腹血糖值明顯高于空白組。從菌門角度上看，模型組的厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值相對升高，擬桿菌門Bacteroidets明顯下降，厚壁菌門Firmicutes、變形菌門Proteobacteria和放線菌門Actinobacteria豐度增加；從菌綱角度上看，模型組的擬桿菌綱Bacteroidia和芽孢桿菌綱Bacilli數(shù)量減少，梭菌綱Clostridia豐度增加；從菌屬上看，模型組的擬桿菌屬Bacteroides、乳桿菌屬Lactobacillus、普雷沃菌屬（Prevotella）、顫螺菌屬Oscillospira和瘤胃球菌屬Ruminococcus豐度增加。

薯蕷粥各劑量組從菌門角度上看，厚壁菌門Firmicutes/擬桿菌門Bacteroidetes比值相對下降，厚壁菌門Firmicutes相對豐度下降，變形菌門Proteobacteria、擬桿菌綱Bacteroidets和放線菌門Actinobacteria豐度均增加；從菌綱角度上看，γ-變形菌綱Gammaproteobacteria和梭菌綱Clostridia數(shù)量均減少；從菌屬角度上看，顫螺菌屬Oscillospira、普雷沃菌屬（Prevotella）和瘤胃球菌屬Ruminococcus數(shù)量均降低。由此可見，薯蕷粥低、中劑量組具有類似二甲雙胍降低空腹血糖值的作用，通過調(diào)節(jié)腸道菌群多樣性及豐度，可以緩解2型糖尿病小鼠的病況。

綜上所述，本文從菌群調(diào)節(jié)角度為薯蕷粥改善模型糖尿病小鼠提供了更深層次的機制探討，后續(xù)實驗將進一步研究其對臨床2型糖尿病患者腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及機制，為深入開發(fā)薯蕷粥這一中國經(jīng)典藥膳提供充足的基礎研究材料。（基金項目：福建中醫(yī)藥大學校管課題，課題編號：“X2019049-學科”）

作者簡介：謝勇（1976-），博士，教授，研究方向：功能性食品研究。