張輝,嚴(yán)關(guān)所,王韶琴,呂念詞,張以芳
(1.瀘西縣白水鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心,云南 瀘西 652404; 2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650201)
豬大腸桿菌病主要引起仔豬黃痢、白痢和水腫病,仔豬腹瀉是養(yǎng)豬生產(chǎn)上比較常見的一種疾病,且在養(yǎng)殖過程中難以根治,會(huì)導(dǎo)致仔豬的生長發(fā)育受阻且死亡率高,嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[1]。大腸桿菌的種類不同,感染仔豬的年齡不同,臨床癥狀也會(huì)不一樣。仔豬黃痢主要發(fā)生在一周齡左右的仔豬,主要表現(xiàn)為排黃色漿狀稀便,剖檢時(shí)尸體嚴(yán)重脫水,腸道內(nèi)有黃色液體狀內(nèi)容物[2]。而仔豬白痢則主要發(fā)生于10~30日齡的仔豬,會(huì)突然腹瀉,排漿狀或糊狀糞便,顏色為乳白色或灰白色,有腥臭味[3]。
大腸桿菌是革蘭氏陰性無芽孢的直桿菌,在MAC平板上生長時(shí)多數(shù)呈現(xiàn)紅色或粉紅色、表面光滑的菌落;在EMB平板上生長呈帶有金屬光澤的菌落,多為綠色或褐色,是區(qū)別其他桿菌的標(biāo)志性現(xiàn)象[4]。生化反應(yīng)活潑是作為大腸桿菌檢測的重要生物學(xué)手段,MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)呈陽性,不和枸櫞酸鹽反應(yīng),不產(chǎn)生尿酸酶等特征[5]。大腸桿菌廣泛分布于自然界,很多大腸桿菌都能夠引起仔豬的腹瀉,主要是產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌、腸致病性大腸桿菌、腸黏附性大腸桿菌等[6],一些菌株在血平板上還有溶血現(xiàn)象。盡管大腸桿菌抗原主要有O、K、H和F四種,然而與腹瀉有關(guān)的O抗原有170多種,K抗原有100種左右,H抗原有50多種[5],不同地區(qū)、季節(jié)或不同年齡之間,流行的大腸桿菌血清型也不相同,大腸桿菌繁多復(fù)雜的血清型也增加了對(duì)其診斷防治的難度[7]。
一直以來,仔豬腹瀉的發(fā)病率有明顯上升的趨勢,本實(shí)驗(yàn)從某豬場疑似大腸桿菌腹瀉的仔豬身上采取樣品,對(duì)其分離菌進(jìn)行表型及16S rDNA鑒定、動(dòng)物致病性試驗(yàn)及藥敏試驗(yàn),為其防治提供了科學(xué)依據(jù)。
紅河州某規(guī)模化豬場仔豬有突然腹瀉、消瘦且同窩相繼發(fā)病的現(xiàn)象,采取糞便及肛門拭子6份。
培養(yǎng)基(HE、MAC、營養(yǎng)肉湯、EMB)、單盒微量生化鑒定管、革蘭染色劑、藥敏紙片。2×Taq Super Mix、DL5000 DNA Marker、雙蒸水。16S rDNA引物序列如下:16S-F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG;16S-R:GGTTACCTTGTTACGACTT。
首先對(duì)樣品進(jìn)行恒溫振蕩擴(kuò)菌,然后分別劃線于HE、MAC、EMB等培養(yǎng)基上37℃恒溫培養(yǎng)18~24h,觀察菌落特點(diǎn),挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢;挑疑似大腸桿菌的菌落于普通肉湯中過夜培養(yǎng),所得菌液分別在MAC和EMB上二次劃線并按照上述方法培養(yǎng),染色鏡檢;再挑取單個(gè)菌落至普通肉湯中進(jìn)行12h過夜,然后接種在加了血液的瓊脂上培養(yǎng)。
將適量無菌生理鹽水及大腸桿菌菌落制成細(xì)菌懸液,然后接種在各微量生化鑒定管,然后將生化管放在37℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24~96h,觀察生化試驗(yàn)結(jié)果。
菌液進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增,本實(shí)驗(yàn)采用25μL體系:2×Easy Taq Super Mix 12.5μL,16S-F、16S-R各1μL,提取的DNA 1μL,ddH2O 9.5μL;瞬時(shí)離心后采用以下程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94℃ 5min、94℃ 30s、54.5℃ 30s、72℃ 1min45s,35個(gè)循環(huán),再72℃延伸5min。反應(yīng)結(jié)束后1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測,陽性樣品膠回收送擎科生物公司測序,測序結(jié)果在Genbank進(jìn)行Blast對(duì)比。
挑取分離菌落于適量高壓滅菌生理鹽水中,制成細(xì)菌懸液,將小鼠分為試驗(yàn)組和對(duì)照組,各腹腔注射300μL的細(xì)菌懸液和滅菌生理鹽水。分開飼養(yǎng),觀察小白鼠的發(fā)病及死亡情況。
取100μL經(jīng)純培養(yǎng)的菌液,用L玻璃棒將菌液均勻涂在瓊脂培養(yǎng)基上,貼上藥敏紙片,37℃培養(yǎng)18~24h,測量抑菌圈的直徑。抑菌圈 15.1mm≤直徑≤20.1mm為高敏、10.1mm≤直徑<15.1mm為中敏、直徑<10.1mm為耐藥。
分離細(xì)菌經(jīng)培養(yǎng)特性、染色特性、生化試驗(yàn)、16Sr DNA擴(kuò)增及測序,確診為大腸桿菌。
經(jīng)過37℃恒溫培養(yǎng)24h后,可以看見在普通瓊脂上形成圓形菌落;在EMB平板上形成有綠色金屬光澤的紫黑色菌落;在血瓊脂上沒有溶血現(xiàn)象;在麥康凱上形成圓形粉紅色菌落,可見表面光滑、扁平、凸起,經(jīng)過連續(xù)傳代后菌落大小均一樣。見圖1。
圖1 在麥康凱培養(yǎng)基上的分離培養(yǎng)
從MAC上挑取菌落進(jìn)行革蘭氏染色,鏡檢可觀察到粉紅色、兩端鈍圓、大小均一的革蘭氏陰性短桿菌。見圖2。
圖2 染色鏡檢結(jié)果
分離菌生化培養(yǎng)鑒定,可使葡萄糖、甘露醇等產(chǎn)酸產(chǎn)氣,乳糖、山梨醇、麥芽糖、MR試劑、VP試劑及蛋白胨水試驗(yàn)陽性,尿素酶、Kotser氏枸櫞酸鹽肉湯、衛(wèi)矛醇試驗(yàn)陰性,符合大腸桿菌的生化特性。
取分離菌株純培養(yǎng)菌液,用16S rDNA引物PCR擴(kuò)增, 都能擴(kuò)增出1500bp大小的特異性目的條帶。見圖3。
M:DL5000 DNA Marker ;N:陰性對(duì)照;1-2:樣品
測序結(jié)果通過Blast對(duì)比,結(jié)果與大腸桿菌的同源性達(dá)99.69%,表明分離菌屬于大腸桿菌。
分離菌株接種小白鼠,24h后小白鼠精神不佳,食欲減少,48h后有腹瀉、呼吸減弱的現(xiàn)象。將小白鼠剖檢,在MAC上接種其組織液培養(yǎng)24h,有粉紅色菌落長出,染色鏡檢與分離菌的形態(tài)一致,表明使小白鼠出現(xiàn)腹瀉的就是大腸桿菌。
分離菌對(duì)頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢哌酮、丁胺卡那霉素、呋喃唑酮(痢特靈)等7種藥高敏;哌拉西林、頭孢氨芐、新霉素、米諾環(huán)素、紅霉素、氧氟沙星、多粘菌素、氯霉素等8種藥中敏;青霉素、苯唑西林、羧芐西林、頭孢拉定、卡那霉素、多西環(huán)素、麥迪霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、萬古霉素、復(fù)方新諾明、克林霉素等12種藥具有耐藥性。
大腸桿菌病在不同養(yǎng)殖業(yè)上有不同的發(fā)病率及病死率,如2016年在黑龍江地區(qū)的平均發(fā)病率高達(dá)40%[8]。大腸桿菌病多用抗生素防治,但隨著抗生素用量的加大,菌株的耐藥性也就隨著產(chǎn)生,薛原等也對(duì)哈爾濱地區(qū)豬場大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行檢測,結(jié)果80株大腸桿菌對(duì)多西環(huán)素等均有耐藥性[9]。鐘雯等對(duì)吉林地區(qū)豬源大腸桿菌分離株進(jìn)行藥物敏感性檢測,結(jié)果表明分離菌株對(duì)氨芐西林、磺胺類藥物中度敏感,對(duì)慶大霉素、頭孢拉定耐藥[10]。本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)到的大腸桿菌對(duì)呋喃唑酮、頭孢曲松等藥物高度敏感,對(duì)頭孢氨芐、多粘菌素等中度敏感,對(duì)青霉素、復(fù)方新諾明等耐藥,與文獻(xiàn)報(bào)道的其他地區(qū)的結(jié)果有一定的差異,差異的存在可能與不同地區(qū)或豬場使用不同抗生素有關(guān)。
大腸桿菌病多為繼發(fā)感染,或由于養(yǎng)殖環(huán)境惡劣而造成。因此,養(yǎng)豬場應(yīng)該做好環(huán)境衛(wèi)生、消毒管理和通風(fēng)換氣等措施,尤其是仔豬,在斷奶前后應(yīng)適當(dāng)限制飼料量,適時(shí)補(bǔ)鐵,增加仔豬本身的抗病力,防止飼料單一和蛋白質(zhì)過高。另外,對(duì)豬場內(nèi)水源進(jìn)行定期檢測,防止大腸桿菌超標(biāo),做好生物安全對(duì)大腸桿菌的防控很重要。