趙宇俠，李晨紅，黎文明，王志正，韓秋琴，陳培清

1. 上海健康醫(yī)學(xué)院協(xié)同科研中心，上海 201318 2. 國(guó)立藥材研究院人參醫(yī)藥研究中心，越南胡志明市 800010

量子點(diǎn)(QDs)一般由Ⅱ～Ⅵ族或Ⅲ～Ⅴ族元素構(gòu)成，也稱半導(dǎo)體納米微晶體，由于其粒徑很小(約2～10 nm)，電子和空穴被量子限域而被稱為量子點(diǎn)。QDs以其穩(wěn)定的熒光性和不易降解等特點(diǎn)在生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中用于體內(nèi)成像及細(xì)胞標(biāo)記[1-5]。此外，QDs的小粒徑及大比表面積也賦予了其高反應(yīng)活性，這使得QDs很容易與共存環(huán)境的其他物質(zhì)以各種方式結(jié)合，比如QDs能夠結(jié)合Cu2+，并且基于結(jié)合后量子點(diǎn)熒光變化的特性衍生出用QDs檢測(cè)Cu2+濃度的方法[6-7]。

銅元素是生物體正常生命代謝活動(dòng)過(guò)程必需的微量礦質(zhì)元素，主要以酶結(jié)合金屬的形式廣泛參與各種生命活動(dòng)。銅構(gòu)成了多酚氧化酶、細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶、多胺氧化酶和鋅超氧化物歧化酶(Zn-SOD)等的蛋白質(zhì)的重要輔因子，主要通過(guò)參與呼吸代謝中的氧化還原反應(yīng)來(lái)參與代謝；然而，盡管銅是生物體所必需的元素，稍微過(guò)量的銅便會(huì)干擾細(xì)胞代謝和離子平衡，對(duì)生物體乃至生態(tài)系統(tǒng)的微生物和植物產(chǎn)生毒害作用[8-9]。肝臟是Cu2+蓄積的重要靶器官。Cu2+的蓄積會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性，很多銅代謝相關(guān)的缺陷導(dǎo)致Cu2+在肝臟內(nèi)緩慢蓄積最后導(dǎo)致肝臟疾病[10-12]。

QDs在生物醫(yī)學(xué)的應(yīng)用帶來(lái)了更多的人體暴露機(jī)會(huì)[13]。銅的主要的暴露路徑是攝食[14]。肝臟是眾所周知的Cu2+富集的靶器官。QDs被證明可以在生物體內(nèi)系統(tǒng)分布并主要滯留在肝臟內(nèi)[15]。因此，QDs和Cu2+可能在肝臟內(nèi)共存并且QDs能夠結(jié)合肝臟環(huán)境中的Cu2+，而QDs作為納米材料曾被證明容易繞過(guò)細(xì)胞膜屏障進(jìn)入細(xì)胞，并且QDs產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)有破壞細(xì)胞膜的作用，那么兩者共存可能通過(guò)QDs破壞細(xì)胞膜，使得Cu2+容易進(jìn)入細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞Cu2+蓄積量增加，從而帶來(lái)細(xì)胞毒性增加，引發(fā)肝臟疾患的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究用人胚肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)作為肝臟的指示細(xì)胞，調(diào)查QDs的加入對(duì)于Cu2+細(xì)胞毒性的改變，同時(shí)考察QDs對(duì)Cu2+細(xì)胞蓄積量的影響，該影響可能解釋細(xì)胞毒性的增加。進(jìn)一步考核細(xì)胞內(nèi)Cu2+泵出蛋白表達(dá)的變化驗(yàn)證以上的Cu2+蓄積帶來(lái)的細(xì)胞應(yīng)激變化，通過(guò)測(cè)定乳酸脫氫酶(LDH)的變化確定細(xì)胞膜的破壞，佐證QDs可能通過(guò)破壞細(xì)胞膜輔助Cu2+進(jìn)入細(xì)胞。本研究旨在闡述QDs和Cu2+的共存對(duì)肝臟的可能威脅，以期為納米材料可能的體內(nèi)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

實(shí)驗(yàn)所用的人胚肝細(xì)胞(L02細(xì)胞)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 試劑

無(wú)水氯化銅，分析純，購(gòu)自Sigma試劑公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco?公司；MTT Cell Proliferation Assay Kit購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司；Cyto Tox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；量子點(diǎn)CdTe-MPA(巰基丙酸)由華東理工大學(xué)化工學(xué)院合成，包覆MPA，直徑為3.7 nm，發(fā)紅光，在水相中合成的發(fā)射波長(zhǎng)為628 nm，物質(zhì)的量濃度為5.8×10-6mol·L-1，質(zhì)量濃度為0.64 mg·mL-1，在pH值6～12范圍內(nèi)穩(wěn)定，合成方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[2]，合成后離心收集，用丙醇純化以去除雜質(zhì)。

1.1.3 儀器

UV7500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海天美生物科技有限公司；F7000型熒光光譜儀，日本日立公司；Tecnai G2 20型透射電鏡(TEM)，美國(guó)FEI公司；Malvern Zetasizer Nano ZS 90型動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)，英國(guó)馬爾文儀器有限公司；7700型等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)儀，美國(guó)Agilent公司；Molecular Imager ChemiDocTMXRS+imaging System凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司；BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 QDs樣品表征

樣品在工作電位為200 kV時(shí)測(cè)定TEM圖像；用UV7500紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)在光程1 cm的光譜池測(cè)定樣品紫外光譜，發(fā)射光譜在F7000型熒光光譜儀上測(cè)定。采用動(dòng)態(tài)光散射法對(duì)QDs的水合粒徑進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件為25℃，散射角90°，激光波長(zhǎng)633 nm。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法

L02細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基加入10%的胎牛血清(FBS)在37 ℃、濕度為95%和5%的CO2條件下培養(yǎng)。

用不同濃度的Cu2+(0、5、10、20和40 μg·mL-1)溶液?jiǎn)为?dú)或與QDs(200 μg·mL-1)聯(lián)合處理細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用于各項(xiàng)分析。QDs從10 mg·mL-1的無(wú)血清的培養(yǎng)基配制的母液稀釋得到，Cu2+溶液從無(wú)菌超純水配制的30 mg·mL-1的母液稀釋得到。

1.2.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板(104個(gè)·孔-1)，培養(yǎng)使細(xì)胞貼壁，棄培養(yǎng)液，每孔加入含Cu2+或QDs-Cu2+的培養(yǎng)基，Cu2+濃度分別為0、5、10、20和40 μg·mL-1，QDs的濃度為200 μg·mL-1，每個(gè)劑量組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔置于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[14]。然后棄去每孔中的培養(yǎng)液，加入含10%噻唑藍(lán)(MTT)(5 mg·mL-1)的DMEM培養(yǎng)基(無(wú)FBS)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去MTT溶液，每孔加二甲基亞砜(DMSO)150 μL后，充分振蕩至紫色的甲臜結(jié)晶完全溶解后，用BioTek Synergy2多功能酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm波長(zhǎng)處的吸光度值，確定相對(duì)于Cu2+單獨(dú)處理組，QDs的加入對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響[16-17]。

1.2.4 LDH釋放的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種于96孔板(104個(gè)·孔-1)，細(xì)胞貼壁后，選擇0、10、20和40 μg·mL-1的Cu2+單獨(dú)及與200 μg·mL-1的QDs聯(lián)合處理細(xì)胞24 h，根據(jù)Cyto Tox 96?非放射性細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟操作，用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定吸光度。

1.2.5 總蛋白提取和蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)

細(xì)胞培養(yǎng)和處理同LDH實(shí)驗(yàn)，給予藥物處理24 h后，置于冰浴，用提前預(yù)冷的PBS(含蛋白酶抑制劑)清洗細(xì)胞2次，加5 mL冷的PBS洗滌，用細(xì)胞刮片收集細(xì)胞，4 ℃、300×g離心5 min，去上清液，加入1 mL總細(xì)胞裂解液，冰浴5 min，4 ℃、16 000×g離心5 min，取上清，BSA作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后加入蛋白上樣緩沖液并于100 ℃下蛋白變性5 min，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

制備8%～10%的SDS-PAGE膠，上樣，以80 V電壓電泳，待條帶跑入分離膠部分，提高到120 V，跑至距離玻璃板底部1 cm左右停止并開(kāi)始轉(zhuǎn)膜。電流調(diào)到350 mA，NC膜低溫濕轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜1～2 h，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液室溫封閉2 h，加對(duì)應(yīng)的一抗(按比例1∶1 000稀釋)與目的蛋白特異性結(jié)合，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST溶液清洗一抗，加對(duì)應(yīng)二抗(比例1∶1 000稀釋)，室溫輕搖孵育1 h，TBST漂洗3次后ECL液顯色，并在凝膠成像系統(tǒng)上顯影，并利用Image J軟件分析各組條帶的灰度值，以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算各組蛋白的變化情況。

1.2.6 細(xì)胞內(nèi)Cu2+含量檢測(cè)

細(xì)胞接種于6孔板(105個(gè)·孔-1)，處理濃度同上，培養(yǎng)24 h后，離心5 min(5 000 r·min-1)，細(xì)胞殘留的上清液從孔中吸出，細(xì)胞用PBS緩沖液洗2次以除去細(xì)胞表面殘留的Cu2+。200 μL的Tritonx-100(0.5%質(zhì)量濃度)溶液加入孔中以裂解細(xì)胞。細(xì)胞再放入-20 ℃的冰箱中反復(fù)凍融直至完全裂解。離心10 min(10 000 r·min-1)，收集上清液采用火焰原子吸收光譜法，以銅特征線(共振線)324.7 nm為分析線，用ICP-MS儀檢測(cè)Cu2+濃度，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)3組平行。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，應(yīng)用Origin7.5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析和T-test檢驗(yàn)，*表示以P<0.05置信度下的差異有顯著性，代表QDs-Cu2+聯(lián)合處理樣品相比于單獨(dú)Cu2+處理的差異顯著。

2 結(jié)果(Results)

2.1 QDs納米粒子的表征

如圖1(a)所示，合成的量子點(diǎn)CdTe-MPA納米粒子的尺寸較均勻，大致呈球形，平均粒徑約為2～10 nm。DLS結(jié)果顯示QDs水合粒徑為100 nm左右，在水溶液中會(huì)有部分團(tuán)聚，分散較均勻(圖1(b))；紫外可見(jiàn)吸收光譜法測(cè)得QDs在530 nm以下吸收較好(圖1(c))；熒光強(qiáng)度在610 nm左右達(dá)到峰值(圖1(d))。

圖1 量子點(diǎn)(QDs)的表征和熒光光譜注：CdTe-MPA QDs的TEM圖(a)；CdTe-MPA QDs的動(dòng)態(tài)光散射(DLS)表征(b)；QDs的紫外吸收光譜(c)；QDs的熒光光譜(d)。CdTe-MPA QDs為巰基丙酸包覆的CdTe量子點(diǎn)。Fig. 1 Characterization of quantum dots (QDs) and fluorescence spectraNote: TEM of CdTe-MPA QDs (a); Dynamic light scattering (DLS) analysis of CdTe-MPA QDs (b); Ultraviolet absorption spectra of QDs (c); Fluorescence spectra of QDs (d). CdTe-MPA QDs represents mercaptopropionic acid-coated CdTe QDs.

2.2 QDs對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響

用MTT實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞形態(tài)變化來(lái)評(píng)估QDs對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。結(jié)果表明，QDs作用24 h后，對(duì)L02細(xì)胞的毒性較低，單獨(dú)的200 μg·mL-1QDs細(xì)胞致死率約為3.6%(表1)；不同濃度的Cu2+處理24 h后，隨著劑量的增大，細(xì)胞增殖能力明顯下降，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；200 μg·mL-1QDs的加入能顯著提高Cu2+的毒性，其中細(xì)胞毒性最大提高了26.0%，表現(xiàn)為協(xié)同作用(圖2(a))。

圖2 QDs的加入對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的影響注： Cu2+和QDs-Cu2+處理對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響(a)；Cu2+(10 μg·mL-1)、QDs(200 μg·mL-1)及QDs(200 μg·mL-1)聯(lián)合Cu2+(10 μg·mL-1)處理的細(xì)胞形態(tài)變化(b)。Fig. 2 Effect of QDs on Cu2+-induced cell viability decreaseNote: Effect of Cu2+ and QDs-Cu2+ treatment on the survival rate of L02 cells (a); Morphological changes of cells treated with Cu2+(10 μg·mL-1) and QDs (200 μg·mL-1) and QDs (200 μg·mL-1) combined with Cu2+(10 μg·mL-1) (b).

通過(guò)在光學(xué)顯微鏡觀察各處理組的細(xì)胞形態(tài)變化(圖2(b))，結(jié)果基本和MTT實(shí)驗(yàn)一致。對(duì)照組為正常的L02細(xì)胞，呈多邊形，具有完整的細(xì)胞核，并且折光性和貼壁狀態(tài)也很好。相對(duì)于Cu2+處理組而言，QDs的加入使細(xì)胞受到更加明顯的傷害。在顯微鏡下觀察可見(jiàn)，活細(xì)胞數(shù)量減少，明顯出現(xiàn)細(xì)胞間質(zhì)消失、細(xì)胞體積縮小和細(xì)胞核濃縮等各種程度的異常形態(tài)變化。

2.3 QDs及Cu2+對(duì)細(xì)胞膜的影響

通過(guò)測(cè)定LDH釋放率來(lái)考察QDs對(duì)細(xì)胞膜的破壞作用，從而推測(cè)細(xì)胞毒性機(jī)理。由圖3可知，不同濃度Cu2+處理組在加入200 μg·mL-1QDs后，均表現(xiàn)出LDH釋放量增加，且隨著Cu2+處理的濃度增加，LDH釋放率變化量增加，其中相對(duì)于對(duì)照組，單獨(dú)QDs(200 μg·mL-1)處理組，LDH釋放率增加了2.8%；加入200 μg·mL-1QDs后，相對(duì)于單獨(dú)10 μg·mL-1Cu2+處理組，LDH釋放率增加了23.6%。

表1 QDs和Cu2+對(duì)L02細(xì)胞存活率的影響Table 1 Effects of QDs and Cu2+ on the survival rate of L02 cells

圖3 Cu2+單獨(dú)及聯(lián)合QDs對(duì)L02肝細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)釋放的影響Fig. 3 Effects of Cu2+ alone and combined with QDs on lactate dehyfrogenase (LDH) release from L02 hepatocytes

2.4 細(xì)胞內(nèi)Cu2+含量變化

為了進(jìn)一步確證QDs的加入帶來(lái)細(xì)胞毒性的增加，用ICP-MS儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)實(shí)際Cu2+含量。由圖4可知，不同濃度Cu2+聯(lián)合QDs(200 μg·mL-1)作用于L02細(xì)胞24 h后，均表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞Cu2+蓄積量增加，相對(duì)于對(duì)照組，單獨(dú)QDs(200 μg·mL-1)組細(xì)胞Cu2+含量增加了6.4%；相對(duì)于單獨(dú)Cu2+(10 μg·mL-1)組，加入QDs(200 μg·mL-1)后，Cu2+細(xì)胞蓄積量明顯增加，增加了431.8%。

2.5 Cu2+解毒蛋白表達(dá)結(jié)果

Western blot法檢測(cè)Cu2+天然解毒蛋白ATP7A、ATP7B及CTR1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)解毒蛋白表達(dá)量增加，也從側(cè)面證明了，Cu2+在細(xì)胞內(nèi)蓄積量確實(shí)增加，這才導(dǎo)致解毒蛋白表達(dá)增加，與QDs(200 μg·mL-1)可能對(duì)細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞作用導(dǎo)致Cu2+蓄積這一推測(cè)相一致。如圖5可知，10 μg·mL-1Cu2+聯(lián)合200 μg·mL-1QDs處理組，相對(duì)于單獨(dú)Cu2+處理組，解毒蛋白表達(dá)不同程度地增加，ATP7A蛋白增加了133.6%，CTR1蛋白增加了57.3%。

圖4 QDs-Cu2+聯(lián)合對(duì)L02肝細(xì)胞內(nèi)Cu2+含量的影響Fig. 4 Effect of QDs-Cu2+ combination on Cu2+ content in L02 hepatocytes

3 討論(Discussion)

無(wú)毒的QDs由于粒徑很小(約2～10 nm)，受小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)等的影響，具備很多優(yōu)異的性質(zhì)，是近年使用率最多的新型納米材料之一[5,18]。其生產(chǎn)量的增加不可避免地帶來(lái)環(huán)境排放量的增加[19]，而且太陽(yáng)能電池、計(jì)算機(jī)、生物傳感器、成像技術(shù)、藥物傳遞和光電探測(cè)器等方面的應(yīng)用可能帶來(lái)QDs的體內(nèi)蓄積[1-5]。Rocha等[20]證明了QDs在體內(nèi)主要在肝臟中蓄積。同時(shí)，由于工業(yè)和自然地理等原因造成Cu2+環(huán)境污染，并且作為人體必需元素也主要富集于肝臟[21]。所以，QDs和Cu2+的聯(lián)合毒性的評(píng)價(jià)和相應(yīng)機(jī)理以及防護(hù)措施的研究等尤其必要。

圖5 Cu2+解毒蛋白ATP7A、ATP7B及CTR1蛋白的表達(dá)注：Cu2+解毒蛋白的Western blot結(jié)果(a)；不同處理對(duì)ATP7A表達(dá)的影響(b)；不同處理對(duì)CTR1表達(dá)的影響(c)。1. 對(duì)照組，2. Cu2+(10 μg·mL-1)，3. Cu2+(10 μg·mL-1)+QDs(200 μg·mL-1)，4. QDs(200 μg·mL-1)。Fig. 5 Expression of Cu2+ detoxification protein ATP7A, ATP7B and CTR1Note: Western blot results of Cu2+ detoxification protein (a); Effects of different treatments on ATP7A expression (b); Effect of different treatments on CTR1 expression (c). 1. Control; 2. Cu2+(10 μg·mL-1); 3. Cu2+(10 μg·mL-1)+QDs(200 μg·mL-1); 4. QDs(200 μg·mL-1).

QDs毒性機(jī)理中有一個(gè)通過(guò)活性氧簇(ROS)導(dǎo)致細(xì)胞膜破壞，使得細(xì)胞的屏障作用消失[10,19]。另外，Cu2+要克服細(xì)胞天然的屏障作用，離細(xì)胞足夠近才能發(fā)揮毒性，而此時(shí)細(xì)胞的天然屏障作用相當(dāng)于被QDs破壞，有了QDs的“輔助”作用，使得Cu2+能夠靠近細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)Cu2+蓄積量增加，導(dǎo)致細(xì)胞毒性增加。

一般而言，細(xì)胞都有對(duì)應(yīng)的金屬離子的天然解毒蛋白，會(huì)防止其過(guò)度蓄積[22-23]，比如Cu2+擁有天然的解毒蛋白ATP7A、ATP7B及CTR1等蛋白?，F(xiàn)解毒蛋白在QDs加入后，表達(dá)量確實(shí)增加，說(shuō)明QDs的加入造成Cu2+蓄積量的增加，導(dǎo)致解毒蛋白的表達(dá)量增加，細(xì)胞自身試圖降低Cu2+蓄積量，以緩沖Cu2+帶來(lái)的毒性作用。因此，關(guān)注無(wú)毒QDs或低毒QDs與Cu2+的復(fù)合毒性是有必要的。

QDs濃度為200 μg·mL-1時(shí)，L02細(xì)胞致死率為3.6%。Cu2+濃度為10 μg·mL-1時(shí)，L02細(xì)胞致死率為16.3%，當(dāng)加入200 μg·mL-1QDs時(shí)，致死率變?yōu)?3.5%，提高了17.2%，說(shuō)明QDs和Cu2+的加入都會(huì)對(duì)L02細(xì)胞產(chǎn)生毒性，并且QDs的加入對(duì)Cu2+誘導(dǎo)的L02細(xì)胞毒性具有顯著協(xié)同作用;細(xì)胞膜完整性被破壞的指示物L(fēng)DH增加，Cu2+的解毒蛋白增加，這證明QDs對(duì)Cu2+誘導(dǎo)L02細(xì)胞毒性增加的機(jī)理可能是通過(guò)破壞細(xì)胞膜作用導(dǎo)致Cu2+蓄積量增加。