李如美，戴爭(zhēng)，王維，張霞，郇恒尚，李丹丹，高宗軍,*

1. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100 2. 南京南農(nóng)農(nóng)藥科技發(fā)展有限公司，南京 210095

隨著農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用，其對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞也日趨嚴(yán)重，農(nóng)藥污染問(wèn)題也已經(jīng)成為全人類廣泛關(guān)注的重大環(huán)境問(wèn)題。農(nóng)藥環(huán)境安全性評(píng)價(jià)工作已成為農(nóng)藥科學(xué)合理施用的基礎(chǔ)，同時(shí)對(duì)保障生態(tài)環(huán)境安全具有重要的作用[1]。農(nóng)藥在田間施用時(shí)，可以通過(guò)多種途徑進(jìn)入水生環(huán)境，引起水資源污染、水生生態(tài)系統(tǒng)破壞和食品安全等一系列問(wèn)題[2]。魚(yú)類作為生態(tài)系統(tǒng)中的重要生物，同時(shí)又是人類的主要食物，農(nóng)藥對(duì)水生生物的急性毒性和生物富集性與農(nóng)藥的合理施用密切相關(guān)，因此，農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類的毒性評(píng)價(jià)工作一直是農(nóng)藥環(huán)境評(píng)價(jià)的重點(diǎn)[3]。

葉菌唑(metconazole)作為一種新型三唑類廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，可有效防治小麥赤霉病、小麥白粉病以及小麥銹病等禾谷類作物病害，在小麥發(fā)病的關(guān)鍵期，化學(xué)防治是控制小麥病變的重要手段[4-6]。小麥作為重要的糧食作物，在中國(guó)人餐桌上的呈現(xiàn)方式多種多樣。因此，評(píng)價(jià)葉菌唑?qū)Ψ前袠?biāo)生物的毒性備受關(guān)注。目前，關(guān)于葉菌唑的研究多集中在小麥病害防治方面[7-8]，但對(duì)哺乳動(dòng)物和非靶標(biāo)生物毒性作用的研究還相對(duì)較少，本研究開(kāi)展了葉菌唑原藥生物富集效應(yīng)和對(duì)斑馬魚(yú)(Brachydaniorerio)急性毒性的研究，為更全面評(píng)價(jià)葉菌唑在環(huán)境中的安全性提供依據(jù)，以減少農(nóng)藥使用過(guò)程中的環(huán)境危害。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試驗(yàn)材料

95%葉菌唑原藥購(gòu)自江蘇耕耘化學(xué)有限公司；助溶劑丙酮購(gòu)自(分析純)天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

斑馬魚(yú)(Brachydaniorerio)購(gòu)買(mǎi)于濟(jì)南夢(mèng)幻水景商貿(mào)有限公司，染毒前在試驗(yàn)條件下馴化7 d。

試驗(yàn)用水為存放并經(jīng)活性炭去氯處理24 h以上的自來(lái)水。水質(zhì)硬度為10～250 mg·L-1(以碳酸鈣計(jì))，pH為6.0～8.5，并且試驗(yàn)期間變化量在±0.5之間，溶解氧保持在試驗(yàn)溫度下飽和值的60%；室內(nèi)溫度為(25±1) ℃。

HQd40便攜式pH計(jì)(梅特勒-托利多，美國(guó))、HQd40便攜式溶解氧測(cè)定儀(梅特勒-托利多，美國(guó))、YD-300水質(zhì)硬度計(jì)(上海三信儀表廠，中國(guó))、Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司，美國(guó))、Z326K高速冷凍離心機(jī)(HERMLE，德國(guó))、SQP百分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，德國(guó))、BSA224S-CW萬(wàn)分之一電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，德國(guó))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)

本試驗(yàn)依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第12部分：魚(yú)類急性毒性試驗(yàn)[9]，采用半靜態(tài)法研究葉菌唑原藥對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)。設(shè)置5個(gè)濃度組，葉菌唑濃度分別為3.18、3.50、3.85、4.25和4.66 mg·L-1，并設(shè)空白對(duì)照組和助溶劑對(duì)照組。將試驗(yàn)用魚(yú)放入按濃度配制的水溶液中，每缸5 L水溶液，每組10尾魚(yú)，并保證各組大小一致，每24 h更換一次試驗(yàn)藥液，測(cè)定溶解氧與pH，記錄96 h每個(gè)魚(yú)缸中斑馬魚(yú)的死亡情況。

1.2.2 斑馬魚(yú)富集試驗(yàn)

參照《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》第7部分：生物富集試驗(yàn)[10]，采用半靜態(tài)法對(duì)斑馬魚(yú)生物富集效應(yīng)進(jìn)行研究。根據(jù)95%葉菌唑原藥對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性的96 h-LC50，以其1/100(3.90×10-2mg·L-1)和1/10(0.39 mg·L-1)設(shè)置2個(gè)處理組濃度，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和溶劑對(duì)照。每個(gè)處理2次重復(fù)，每次重復(fù)40條魚(yú)。8 d內(nèi)每24 h更換試驗(yàn)藥液，并于0、24、48、96、144和192 h分別從各處理中取水樣與魚(yú)樣，對(duì)水樣與魚(yú)樣中供試物含量以及pH、水溫和溶解氧含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)觀察記錄試驗(yàn)魚(yú)中毒癥狀和死亡數(shù)。

1.2.3 儀器分析方法

Agilent1260高效液相色譜儀檢測(cè)條件：紫外檢測(cè)器的檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm；流動(dòng)相為甲醇：水(75∶25，V∶V)，流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣體積為20 μL；柱溫為30 ℃，色譜柱為SB-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)。

1.2.4 樣品前處理

水樣：取20 mL水樣于分液漏斗中，加入20 mL二氯甲烷，萃取2次，取下層液體于雞心瓶中，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，甲醇溶解定容至1 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

魚(yú)樣：將每個(gè)魚(yú)缸中的魚(yú)用0.8% NaCl溶液清洗，于離心管中稱重，加入10 mL乙腈，勻漿2 min，按每1 g樣品加1 g無(wú)水硫酸鈉。超聲15 min，6 000 r·min-1離心10 min，取上清液于雞心瓶中。殘?jiān)性偌尤?0 mL乙腈，重復(fù)提取一次，合并上清液。50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，甲醇溶解定容至5 mL。用5 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)：V(甲醇)=95∶5)活化弗羅里硅土小柱，將定容的5 mL溶液全部加入到柱頂進(jìn)行凈化，用5 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶液(V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=95∶5)洗脫2次，收集洗脫液，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，甲醇溶解定容至1 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用甲醇配制0.10、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mg·L-1葉菌唑系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液按上述條件進(jìn)樣分析，以濃度-峰面積繪制葉菌唑標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為y=44.903x+1.4488 (R2=0.9999)。結(jié)果表明，葉菌唑在0.10～10.00 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性良好。

水樣中添加回收率測(cè)定：分別向試驗(yàn)用水中添加試驗(yàn)農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，使其濃度為0.39和0.039 mg·L-1，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)重復(fù)，采用上述前處理和儀器分析方法，測(cè)定試驗(yàn)農(nóng)藥濃度。平均回收率為90.32%～90.96%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.25%～3.54%。

魚(yú)樣中添加回收率測(cè)定：在魚(yú)中添加葉菌唑標(biāo)準(zhǔn)溶液，設(shè)0.39 mg·L-1和3.9 mg·L-12個(gè)添加濃度，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行。平均回收率為91.63%～96.17%，RSD為3.85%～4.84%。

統(tǒng)計(jì)分析：斑馬魚(yú)急性毒性試驗(yàn)96 h-LC50值以及95%的置信限由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0計(jì)算而得。生物富集系數(shù)(BCF)計(jì)算公式為BCF=Cfs/Cws，其中，Cfs為平衡時(shí)魚(yú)體內(nèi)的供試物含量，Cws為平衡時(shí)水體內(nèi)的供試物含量。依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中的標(biāo)準(zhǔn)，判斷戊唑醇對(duì)斑馬魚(yú)的毒性等級(jí)與富集效應(yīng)等級(jí)。

2 結(jié)果(Results)

半靜態(tài)試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)過(guò)程中空白對(duì)照組以及助劑組的斑馬魚(yú)與試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)相比無(wú)明顯變化。95%葉菌唑原藥對(duì)斑馬魚(yú)急性毒性的96 h-LC50為3.89 mg·L-1(表1)。95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/100試驗(yàn)處理組中，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)(192 h)，魚(yú)體中葉菌唑含量尚未達(dá)到平衡，斑馬魚(yú)對(duì)葉菌唑的生物富集系數(shù)(BCF8d)為26.2(表2)。95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/10試驗(yàn)處理組中，4 d時(shí)水體及魚(yú)體中葉菌唑含量達(dá)到平衡，斑馬魚(yú)對(duì)葉菌唑的生物富集系數(shù)(BCF)為53.3(表3)。

表1 95%葉菌唑?qū)Π唏R魚(yú)的致死率Table 1 The mortality rate of Brachydanio rerio induced by 95% metconazole

表2 95%葉菌唑原藥在斑馬魚(yú)體中的生物富集性(葉菌唑溶液初始濃度為0.039 mg·L-1)Table 2 The bioconcentration of 95% metconazole in Brachydanio rerio (the original concentration of metconazole is 0.039 mg·L-1)

表3 95%葉菌唑原藥在斑馬魚(yú)體中的生物富集性(葉菌唑溶液初始濃度為0.39 mg·L-1)Table 3 The bioconcentration of 95% metconazole in Brachydanio rerio (the original concentration of metconazole is 0.39 mg·L-1)

3 討論(Discussion)

溶劑和助劑本身會(huì)對(duì)魚(yú)類造成毒性傷害，因此，在農(nóng)藥對(duì)魚(yú)類毒性試驗(yàn)中應(yīng)該盡量避免[11]。本研究選用的助劑為丙酮，急性毒性試驗(yàn)和生物富集試驗(yàn)的溶劑對(duì)照組中均未觀察到斑馬魚(yú)死亡和異常行為，說(shuō)明丙酮=的影響可以忽略不計(jì)。

魚(yú)類生物富集試驗(yàn)對(duì)評(píng)價(jià)農(nóng)藥的環(huán)境行為及其慢性危害有十分重要的意義[12]。葉菌唑生物富集試驗(yàn)結(jié)果表明，95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/100試驗(yàn)處理中，斑馬魚(yú)對(duì)葉菌唑的生物富集系數(shù)(BCF8d)為26.2，95%葉菌唑原藥96 h-LC50的1/10試驗(yàn)處理中，斑馬魚(yú)對(duì)葉菌唑的生物富集系數(shù)(BCF)為53.3，依據(jù)《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》[11-12]判斷為中等富集性。農(nóng)藥的水溶性和分配系數(shù)等與其生物富集性有關(guān)聯(lián)，葉菌唑原藥微溶于水，正辛醇-水分配系數(shù)較高，因此，其在魚(yú)體內(nèi)富集作用較強(qiáng)[13]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，葉菌唑在斑馬魚(yú)體內(nèi)屬于中等富集性農(nóng)藥。因此，田間施用葉菌唑時(shí)，需特別注意其施用量、使用范圍和使用方法，應(yīng)盡量避免其在水邊使用以減少對(duì)魚(yú)類的危害。此外，為了更加系統(tǒng)準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)葉菌唑的環(huán)境安全性，還需進(jìn)行其他非靶標(biāo)生物的毒性試驗(yàn)以及環(huán)境歸趨試驗(yàn)等[14-15]。