嚴勛，唐杰，李冰，王昌全，徐強，蔡欣，付鑠嵐

四川農業(yè)大學資源學院，成都 611130

近年來，重金屬在世界上很多地方(包括中國)已造成嚴重的土壤污染問題[1]。Cd每年大約有3萬t排放到環(huán)境中，其中約13 000 t來源于人類活動，如發(fā)電站、供暖系統(tǒng)、金屬加工業(yè)、垃圾焚燒爐、城市交通、水泥廠和農業(yè)磷肥的施用等[2]。Cd比較容易被植物吸收并積累，當植物體內積累過量Cd后，會對植物自身產生嚴重的毒害作用，而Cd最終也會隨食物鏈進入人體，對人體造成嚴重危害，威脅人類健康[3]。水稻是世界上主要的糧食作物，且易于積累Cd[4]，其根系對Cd有較強的吸收能力，并通過木質部將其轉運到地上部最后積累于籽粒中[5]。因此，在糧食安全生產問題上，含Cd大米將對人類健康造成嚴重的安全隱患。

不同水稻品種對Cd吸收和積累存在差異[6]。研究表明，在Cd脅迫下，高積累品種能夠更多地往地上部轉運Cd[7]，低積累品種能夠合成更多的非蛋白質巰基和谷胱甘肽等物質，從而限制Cd的遷移，而陽離子態(tài)Cd在高積累品種中含量更高[8-9]。OsNramp5和OsHMA2與Cd的吸收和轉運相關，OsHMA3與Cd的液泡區(qū)隔相關[10-11]，研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫能顯著提升OsNramp5和OsHMA2在高積累品種中的表達量，而OsHMA3在低積累品種中的表達量更高[12]。這些不同水稻品種在Cd脅迫下的生理差異導致了不同水稻品種對Cd吸收積累的差異。

植物亞細胞組分中細胞壁對于重金屬沉降起著重要作用[13]，當植物細胞壁上的重金屬結合位點飽和時，細胞內的重金屬會與大量的有機配位體結合形成穩(wěn)定態(tài)的螯合物，并被轉運至液泡中儲藏，降低細胞質中自由重金屬離子的濃度[14]?，F(xiàn)有研究表明，重金屬的亞細胞分布，有利于闡述重金屬在植物體內的差異特征[15-17]，關于Cd在不同水稻品種亞細胞中的分布研究，大多單一地統(tǒng)計水稻組織亞細胞組分中的Cd含量[18-19]，從微觀層次闡述Cd在不同水稻品種各組織部位亞細胞分布的差異，及其與Cd轉運關系的報道結論也不統(tǒng)一。而且大部分研究僅以單一品種水稻為研究對象，具有局限性，關于比較不同基因型水稻差異的相關文章相對較少。因此，本研究通過盆栽試驗，比較不同水稻品種各組織中Cd的分配規(guī)律及其與Cd亞細胞分布特征的關系，為培育Cd低積累水稻品種和水稻安全生產提供科學依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 供試材料

供試水稻材料為前期篩選得到的籽粒Cd低積累水稻品種越冬稻、R1088(下面統(tǒng)一簡稱“低積累品種”)和籽粒Cd高積累水稻品種IR34582、太粳558(下面統(tǒng)一簡稱“高積累品種”)，其生育期基本一致(150 d)，均由四川農業(yè)大學水稻研究所提供。

供試土壤為水耕人為土，采自成都市溫江區(qū)公平鎮(zhèn)惠合村(103.86845E, 30.72228N)，其基本理化性質如表1所示。

1.2 試驗設計

試驗于2016年4月至2016年10月在四川農業(yè)大學溫室內進行，光、水、氣和熱等環(huán)境條件均為自然狀態(tài)，無人為干擾。挑選顆粒飽滿的水稻種子用30%的H2O2溶液消毒30 min，蒸餾水洗凈后加0.1%的NaClO溶液殺菌20 h，再用37 ℃蒸餾水在恒溫培養(yǎng)箱進行催芽處理48 h。選取露白的種子置于放有濕潤石英砂的育苗盤中培養(yǎng)，待水稻種子出苗后，用1/4濃度的營養(yǎng)液進行澆灌培養(yǎng)，營養(yǎng)液的配制參照李冰等[20]的方法。在幼苗移栽前35 d對供試土壤作加Cd(CdCl2·2.5H2O)陳化處理，設置3個Cd處理水平：Cd0(不加Cd)、Cd5(5 mg·kg-1)和Cd25(25 mg·kg-1)，每個處理設3個重復，4個水稻材料共計36桶，供試土壤裝在10 L的塑料桶中，每桶裝7 kg(干土重)。待幼苗三葉一心時取長勢一致、健康的水稻幼苗插秧移栽至培育好的Cd污染土壤中。氮、磷和鉀肥分別選用尿素、磷酸二氫鉀和氯化鉀，用量分別為200、100和105 mg·kg-1土，全部的磷、鉀肥和30%的氮肥在移栽前一天作為基肥施入，剩余氮肥在水稻分蘗期(30%)和拔節(jié)期(40%)分2次進行追施，隨后按照常規(guī)管理，做好防治病蟲害工作。于水稻成熟期收獲樣品進行室內分析測定。

表1 供試土壤基本理化性質Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soil

1.3 測定項目及方法

1.3.1 土壤基本理化性質測定

土壤基本理化性質測定參照張甘霖和龔子同[21]的方法。

1.3.2 Cd在水稻植株各器官的亞細胞分布

亞細胞的分離參照Liu等[22]的方法。先將水稻根、莖、葉鞘和葉分別取樣置于不同的分類袋中，然后在分類袋中稱取混合均勻的根、莖、葉鞘和葉1.0 g鮮樣，加入20 mL提取液后，在研缽中冰浴研磨成勻漿，提取液組成為50 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)+250 mmol·L-1蔗糖+1.0 mmol·L-1二硫赤蘚糖醇(DTE)+5.0 mmol·L-1抗壞血酸+1.0%(W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)。勻漿液首先經240 μm尼龍布過濾，殘渣為細胞壁部分(F1)；濾液經高速冷凍離心機(Model ALLEGRA-64R, Beckman Coulter. Inc. USA)4 ℃下以10 000 g離心30 min，沉淀部分為細胞器部分(F2)；取上清液再次經高速冷凍離心機4 ℃下以50 000 g離心30 min，沉淀部分為細胞膜部分(F3)，上清液為可溶部分(F4)(主要包括細胞質、有機物、無機離子和液泡內的大分子)。所有的化學試劑均采用優(yōu)級純，購自成都科隆化學品有限公司。

1.3.3 Cd含量測定

取細胞壁(F1)、細胞器(F2)和細胞膜(F3)部分在70 ℃下烘干的樣品，以及水稻成熟期的根及地上部粉碎樣共0.3 g，加10 mL HNO3-HClO4(4:1，V/V)混合液消化24 h，在高溫條件下消煮至澄清并用去離子水過濾到50 mL容量瓶中定容，用原子吸收分光光度計(Analyst 800, Perkin Elmer, USA)測定Cd含量。以國家標準物質GSB-22(Cd含量為(0.018±0.002) mg·kg-1)為內標控制分析質量。所有的化學試劑均采用優(yōu)級純，購自成都科隆化學品有限公司。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

運用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析，采用LSD檢驗方法進行差異顯著性分析(P<0.05)；運用Excel 2016進行數(shù)據(jù)處理與圖表制作。

Cd轉運效率：TFA-B=B器官中Cd含量/A器官中Cd含量×100%[23-24]。

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)進行不同水稻品種各組織間轉運效率與亞細胞分布比例的相關性分析，其中，TF根-莖與細胞壁Cd分配比例相關性分析即為TF根-莖與根中細胞壁Cd分配比例相關性分析。

2 結果與分析(Results and analysis)

2.1 不同濃度Cd處理中水稻各組織Cd含量及其轉運效率

不同濃度Cd處理中水稻各組織部位Cd含量情況如表2所示。水稻各組織部位Cd含量均隨Cd處理濃度的增加而增加，Cd主要集中于根系，低積累品種根系Cd所占比例約83%，而高積累品種根系Cd所占比例約65%，各組織部位Cd含量依次為根系﹥莖﹥葉鞘﹥葉﹥糙米。Cd5處理組中，低積累品種越冬稻和R1088根系Cd含量分別為27.2和26.5 mg·kg-1，顯著高于高積累品種(P<0.05)，且低積累品種越冬稻和R1088糙米Cd含量分別為0.10和0.07 mg·kg-1，均低于國家標準(GB 2762—2012)的糙米Cd含量限值0.2 mg·kg-1；Cd25處理中，低積累品種越冬稻和R1088根系Cd含量分別為78.5和75.4 mg·kg-1，顯著高于Cd高積累品種IR34582和太粳558(P<0.05)；然而，Cd5和Cd25處理中，低積累品種莖、葉鞘、葉和糙米Cd含量卻顯著低于高積累品種(P<0.05)。

表2 不同濃度Cd處理中水稻各組織Cd含量Table 2 Cd content in different tissues of rice under different levels of spiked cadmium

注：同列不同小寫字母表示不同水稻品種在同一Cd濃度條件(0、5和25 mg·kg-1)下在P<0.05上差異顯著；下同。

Note: Different small letters within one column mean different rice varieties in the same concentration of Cd (0, 5 and 25 mg·kg-1) showing significant differencebetween Cd treatments at the 0.05 level; the same as below.

不同濃度Cd處理中水稻各組織Cd轉運效率情況如由圖1所示。在Cd0處理時，高、低積累水稻各組織間Cd轉運效率無顯著差異；在5 mg·kg-1和25 mg·kg-1Cd脅迫下，低積累品種TF根-莖、TF莖-籽粒、TF葉鞘-籽粒和TF葉-籽粒均顯著低于高積累品種。

2.2 不同水稻品種根系Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種根系Cd亞細胞分布及其分配比例如表3所示。Cd脅迫下，低積累品種根F1、F2、F3和F4中Cd含量均顯著高于高積累品種；根中亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約75%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F3﹥F2；低積累品種越冬稻和R1088根F1分配比例均顯著高于高積累品種IR34582和太粳558，而根F4分配比例卻均顯著低于高積累品種IR34582和太粳558；Cd脅迫下，根F2和F3中Cd分配比例無顯著差異。

表3 不同水稻品種根中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 3 Subcellular distribution of Cd in the roots of different rice cultivars

2.3 不同水稻品種莖中Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種莖中Cd亞細胞分布及其分配比例如表4所示。Cd脅迫下，低積累品種莖F1、F2、F3和F4中Cd含量均顯著低于高積累品種；莖中亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約75%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F2﹥F3；低積累品種越冬稻和R1088莖F1分配比例均顯著高于高積累品種IR34582和太粳558，而莖F4分配比例卻均顯著低于高積累品種IR34582和太粳558；Cd脅迫下，莖F2和F3中Cd分配比例無顯著差異。

表4 不同水稻品種莖中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 4 Subcellular distribution of Cd in the stems of different rice cultivars

圖1 不同濃度Cd處理中水稻各組織間Cd轉運效率注：不同小寫字母表示在同一Cd濃度條件(5和25 mg·kg-1)下不同水稻品種各組織間轉運效率在P<0.05上差異顯著，TFR-S表示TF根-莖，TFS-B表示TF莖-糙米，TFLS-B表示TF葉鞘-糙米，TFL-B表示TF葉-糙米。Fig. 1 Cd transport efficiency among rice tissues under different levels of Cd concentrationNote: Different small letters mean the translocation efficiency of different rice varieties in the same concentration of Cd (5 and 25 mg·kg-1) showing significant difference between Cd treatments at 0.05 levels. TFR-S means TFroot-stem, TFS-B means TFstem-brown rice, TFLS-B means TFleaf sheath-brown rice, TFL-B means TFleaf -brown rice.

2.4 不同水稻品種葉鞘Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種葉鞘Cd亞細胞分布及其分配比例如表5所示。Cd脅迫下，低積累品種葉鞘F1、F2、F3和F4中Cd含量均顯著低于高積累品種；葉鞘亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約70%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F2﹥F3；低積累品種葉鞘中F1、F2、F3和F4中Cd分配比例與高積累品種無顯著差異。

表5 不同水稻品種葉鞘中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 5 Subcellular distribution of Cd in the sheaths of different rice cultivars

2.5 不同水稻品種葉中Cd亞細胞分布及其分配比例

不同水稻品種葉中Cd亞細胞分布及其分配比例如表6所示。Cd脅迫下，低積累品種葉F1、F2、F3F3和F4中Cd含量均顯著低于高積累品種；葉中亞細胞組分Cd分配主要集中于F1和F4(大約75%以上)，Cd分配比例依次為F1﹥F4﹥F2﹥F3；低積累品種葉中F1、F2、F3和F4中Cd分配比例與高積累品種無顯著差異。

表6 不同水稻品種葉中Cd亞細胞分布及其分配比例Table 6 Subcellular distribution of Cd in the leaves of different rice cultivars

2.6 不同水稻品種各組織間轉運效率與亞細胞分布比例的相關性分析

不同水稻品種各組織間轉運效率與Cd亞細胞分布比例的相關性分析如表7所示。TF根-莖與細胞壁(F1)Cd分配比例相關性分析即為TF根-莖與根中細胞壁(F1)的Cd分配比例相關性分析。

在Cd5中，TF根-莖和TF莖-糙米均與F1分配比例成顯著負相關，相關系數(shù)分別為-0.893和-0.974(P<0.01)，TF根-莖和TF莖-糙米均與F4分配比例成顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.869和0.979(P<0.01)；在Cd25中，TF根-莖和TF莖-糙米均與F1分配比例成顯著負相關，相關系數(shù)分別為-0.852和-0.934(P<0.01)。TF根-莖和TF莖-糙米均與F4分配比例成顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.887和0.934(P<0.01)。

Cd脅迫下，根中F1、F4均與TF根-莖相關性顯著；莖中F1、F4均與TF莖-糙米相關性顯著；而葉鞘中F1、F4均與TF葉鞘-糙米相關性不顯著；葉中F1、F4均與TF葉-糙米相關性不顯著。

在Cd5中，TF根-莖與F2分配比例成顯著正相關，相關系數(shù)為0.704(P<0.05)，TF根-莖與F3分配比例成顯著正相關，相關系數(shù)為0.711(P<0.01)，而在Cd25中相關性不顯著；在Cd5中，TF葉鞘-糙米與F4分配比例成顯著正相關，相關系數(shù)為0.660(P<0.05)，而在Cd25中相關性不顯著。

3 討論(Discussion)

水稻不同器官對Cd的吸收能力存在很大差異，其中以根吸收富集Cd的能力最強，一般以根>莖葉>籽粒的順序遞減[25]。有研究表明，Cd脅迫下，不同Cd積累特性水稻根系Cd含量均顯著高于地上部[26-27]。本研究與前人研究結果一致，Cd脅迫下，Cd大多數(shù)積累于根系部位，低積累品種可以積累80%以上的Cd，高積累品種可以積累60%以上的Cd。這說明根系的滯留作用是植物應對Cd脅迫的重要機制[28-29]。

表7 不同水稻品種各組織間轉運效率與Cd亞細胞分布比例的相關系數(shù)(r)Table 7 Correlation coefficient (r) between the subcellular distribution ratios of Cd and translocation factors (TF) of Cd in rice

注：“*”代表相關性在P<0.05水平上顯著；“**”代表相關性在P<0.01水平上顯著。

Note: “*” significance atP<0.05; “**” significance atP<0.01.

根系對Cd的吸收轉運、地上部對Cd的分配決定了籽粒Cd的積累。轉運效率反映Cd在水稻組織中的轉運能力，轉運效率越大，其在組織間的轉運能力就越強，對籽粒Cd積累的影響就越大[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，高積累水稻品種根系、莖和葉Cd含量均高于低積累水稻品種[30]。本研究中，Cd脅迫下高積累水稻品種根系Cd含量顯著低于低積累水稻品種，而地上部各部位Cd含量卻均顯著高于低積累水稻品種。這可能與不同水稻品種間本身的遺傳特性相關[31-32]。已有研究表明，高積累品種根系往地上部轉運Cd的效率高于低積累水稻品種[30,33]，本研究結果與前人的研究結果類似，低積累品種往地上部轉運Cd的能力顯著低于高積累品種，越冬稻和R1088轉運效率TF根-莖只有10%左右，而IR3482和太粳558高達20%以上；同時，越冬稻和R1088地上部往糙米轉運Cd的能力也均顯著低于IR3482和太粳558。相比低積累品種，高積累品種更多地往地上部轉運Cd是導致不同Cd積累特性的重要機理[34]。

在亞細胞水平上能深入研究水稻對Cd的吸收轉運、積累和耐受機制[35]。細胞壁沉降Cd以及細胞內的區(qū)隔化作用是植物體內部鈍化Cd的2個重要過程[36]，細胞壁是保護水稻免受Cd毒害的第一道屏障，其上的纖維、半纖維和果膠等物質能阻止Cd進入原生質層[37]，因此，不同水稻品種各組織亞細胞組分中，細胞壁的Cd含量及分配比例均最高。當少量Cd進入植物細胞原生質層后，只有少部分會以游離態(tài)的形式存在于細胞中，大部分會與一些小分子化合物以螯合態(tài)的形式存在于可溶部分中[38]，所以Cd大部分存在于細胞壁和可溶部分中[30,39]。目前，關于Cd在亞細胞中的分布仍存在爭議，張路等[40]研究發(fā)現(xiàn)，Cd脅迫下，水稻材料中Cd的亞細胞分布表現(xiàn)為可溶部分>細胞壁>細胞器，而另有研究發(fā)現(xiàn)，Cd的亞細胞分布表現(xiàn)為細胞壁>可溶部分>細胞器[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，不同基因型水稻同一品種各組織Cd亞細胞分配比例均表現(xiàn)為細胞壁>可溶部分>細胞膜、細胞器，對比高、低積累水稻品種間根和莖亞細胞組分Cd分配比例發(fā)現(xiàn)，越冬稻和R1088細胞壁分配比例均顯著高于IR3482和太粳558；而越冬稻和R1088可溶部分分配比例卻均顯著低于IR3482和太粳558；在葉鞘和葉中，兩者分配比例在不同品種之間無顯著差異，這與Liu等[22]的研究結果一致。這些研究結果的差異可能是由于實驗處理以及栽培品種的不同導致[40]，而高、低積累水稻品種間根和莖亞細胞組分Cd分配比例的不同，可能是導致它們從根部往地上部轉運Cd以及從莖往糙米轉運Cd的能力存在差異的直接原因。

亞細胞組分細胞壁在水稻Cd沉積中起主要作用，并抑制Cd從根到莖的轉運[41]，可溶部分則是水稻將Cd轉運到籽粒中主要的Cd亞細胞池[42]。本研究發(fā)現(xiàn)，高、低積累品種間，根與莖的細胞壁和可溶部分Cd分配比例存在較大差異。通過相關性分析發(fā)現(xiàn)，在Cd脅迫下，TF根-莖和TF莖-糙米與細胞壁中Cd分配比例均成顯著負相關，而TF根-莖和TF莖-糙米與可溶部分分配比例均呈顯著正相關。由此可以推知，根和莖中細胞壁和可溶部分Cd的亞細胞分布是影響Cd從根部轉運到地上部以及莖到籽粒的重要因素。一定濃度Cd脅迫下(Cd5時)，TF根-莖與根中細胞器和細胞膜分配比例存在顯著相關性，而在Cd25時相關性不顯著，TF葉鞘-糙米與可溶部分分配比例也存在相同關系，這可能因為Cd超過一定范圍后打破了植物對Cd的耐受機制[43]，影響了Cd在水稻中的吸收轉運所致。

不同水稻品種對Cd的吸收、轉運和分配存在差異，不僅僅是亞細胞組分Cd分配比例不同所致。有研究發(fā)現(xiàn)，非蛋白巰基(NPT)和谷胱甘肽(GSH)是影響Cd遷移的重要物質[9]，水稻OsHMA2等基因編碼的陽離子轉運蛋白能夠攜帶Cd2+從根系向地上部運輸[44]，水稻在成熟過程中，OsPCR1與Cd向籽粒的運輸密切相關[45]，其具體生理、分子機理有待進一步研究。

本文得出的主要結論如下：

(1)在不同水稻品種中，Cd大部分積累于水稻根系中；低積累品種根系Cd含量高于高積累品種，而地上部各組織部位Cd含量均低于高積累品種；高積累品種往地上部轉運Cd的能力更強。

(2)不同基因型水稻品種各組織部位Cd的亞細胞分布存在差異，低積累品種根和莖中細胞壁Cd分配比例高于高積累品種，而可溶部分Cd分配比例卻低于高積累品種。這說明細胞壁和可溶部分在Cd遷移過程中起著重要作用。

(3)在高、低積累品種中，TF根-莖和TF莖-糙米均與細胞壁Cd分配比例成顯著負相關關系，而與可溶部分成顯著正相關關系。這說明細胞壁具有較強的Cd固持能力，是限制Cd遷移的重要物質；而Cd的遷移是伴隨可溶部分一同進行，可溶部分Cd分配比例越高，Cd遷移能力越強。

致謝：感謝四川農業(yè)大學水稻研究所李健博士在實驗中提供的幫助。