季曉亞，楊明嘉，黃超，袁圣武，周小紅，饒凱鋒，馬梅,*，王子健

1. 中國科學院生態(tài)環(huán)境研究中心，中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京 100085 2. 中國科學院大學資源與環(huán)境學院，北京 100190 3. 清華大學環(huán)境學院，環(huán)境與健康傳感技術中心，ESPC國家重點聯(lián)合實驗室，北京100084

內(nèi)分泌干擾物是一類干擾生物體保持自身平衡和調(diào)節(jié)發(fā)育過程中天然激素的合成、分泌、轉(zhuǎn)運、結(jié)合或代謝等作用的外源性物質(zhì)，包括環(huán)境雌激素(environmental estrogen, EEs)、環(huán)境雄激素和環(huán)境甲狀腺激素等。目前，內(nèi)分泌干擾物中有超過200種的化學物質(zhì)已被證實為EEs[1]，EEs來源多樣，分布廣泛，已成為研究者關注的重點。經(jīng)典的EEs信號轉(zhuǎn)導是以配體依賴的方式實現(xiàn)的，也被稱為基因組途徑，由雌激素核受體(nuclear estrogen receptor, nER)介導[2]，通過擴散進入細胞的類雌激素物質(zhì)或細胞內(nèi)合成的雌激素識別nER的配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)，使得受體的構(gòu)象發(fā)生改變，形成同源二聚體，隨后募集共調(diào)節(jié)因子包括共激活因子和共抑制因子，進而促進或抑制EEs-nER復合物與下游靶基因啟動子雌激素反應元件(ERE)的結(jié)合，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[3]。根據(jù)此途徑中EEs與nER的結(jié)合、共激活因子和ERE的作用，研究者們開發(fā)了多種EEs活性的離體檢測方法，如ER競爭結(jié)合試驗、重組酵母雌激素篩檢法、熒光素酶表達基因法(ER-CALUX)等[4]，但這些方法都是基于EEs對人體ER的影響而評估其雌激素效應，為了更全面地分析EEs可能導致的生態(tài)風險，需要考慮EEs對魚類模式生物ER的影響。

稀有鮈鯽是我國特有的一種淡水魚類，其易于實驗室培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度范圍寬，生命周期短，受精率和孵化率高，已成為廣泛應用于水生毒性研究的模式生物。由于生態(tài)系統(tǒng)的敏感種和優(yōu)勢種具有較強的地域特性，使用我國本土的受試生物既能真實地反映化學品對我國本土生態(tài)系統(tǒng)的影響，又可以對歐美發(fā)達國家主導的化學品測評體系進行補充[5]。研究表明，哺乳動物中表達ERα和ERβ這2種雌激素核受體亞型，而在硬骨魚體內(nèi)，普遍存在3種雌激素受體亞型ERα、ERβ1和ERβ2介導雌激素的作用，其中，在虹鱒魚中還發(fā)現(xiàn)ERα的亞型ERα1和ERα2。這些不同亞型的ER在魚體內(nèi)具有獨特的組織分布模式、不同的配體親和力和配體暴露后不同的基因調(diào)控模式[6]，有研究報道，青鳉、三刺魚、斑馬魚、鯉魚和擬鯉中不同亞型ER的LBD在ER對EEs的識別及響應中起著關鍵性的作用[1]。同樣地，在稀有鮈鯽體內(nèi)存在ERα、ERβ1和ERβ2這3種ER亞型，Wang等[7]通過對稀有鮈鯽ERα、ERβ1和ERβ2各功能域序列比對分析發(fā)現(xiàn)，DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ERα/β1: 90.9%、ERα/β2: 97%、ERβ1/β2: 90.1%)和LBD(ERα/β1: 58.4%、ERα/β2: 59.7%、ERβ1/β2: 74.1%)具有較高的相似性，表明三者在識別反應元件和調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄方面具有高度的相似性，但在配體親和力方面可能具有一定程度的差異。目前，有關稀有鮈鯽不同ER亞型的LBD與配體間相互作用的研究仍未見報道。

重組雌激素受體基因酵母是根據(jù)EEs-nER復合物與共激活因子之間的相互作用而構(gòu)建的，用以評估EEs的類/抗雌激素效應的同時，也可以表明EEs與ER-LBD的相互作用。為了更加快速方便地檢測雌激素效應，本實驗室對傳統(tǒng)的雙雜交宿主酵母Y187的基因進行了改良，在其基因組上插入了可以被GAL4調(diào)控的報告基因熒光素酶(luciferase, Luc)的片段，已構(gòu)建成Y187-Luc酵母。本研究利用酵母雙雜交技術在Y187-Luc中構(gòu)建不同稀有鮈鯽ER亞型的重組熒光雙雜交酵母，用于檢測環(huán)境雌激素和環(huán)境水體的雌激素活性，同時也可以研究稀有鮈鯽不同ER亞型的LBD與配體之間的相互作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗儀器

恒溫振蕩培養(yǎng)箱(HZQ-F100，中國，哈東聯(lián))；高壓高溫滅菌鍋(MJ，美國，STIK)；超凈工作臺(SCB，中國，哈東聯(lián))；量程不同的移液器(德國，Eppendorf)。

1.2 試劑材料

17β-雌二醇(E2，純度99%)、雙氫睪酮(DHT，純度99%)、9-順維甲酸(9-cisRA，純度98%)、三碘甲狀腺原氨酸(T3，純度98%)和孕酮(PG，純度98%)購于百靈威化學品有限公司，檸檬酸、檸檬酸鈉和D-熒光素購于美國Sigma公司。感受態(tài)大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收質(zhì)粒試劑盒、1kb DNA marker、氨芐青霉素和卡那霉素均購自Tiangen生物試劑公司。酵母轉(zhuǎn)化試劑盒購于Clontech公司。誘餌質(zhì)粒(pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD)的構(gòu)建由北京華大科技公司完成，DNA序列測定由北京博邁德科技發(fā)展有限公司完成。Y187-Luc酵母菌株由本實驗室自主合成[8]，pGAD424-GRIP1質(zhì)粒由美國加州大學Stallcup教授惠贈且保存在本實驗室[9]。

1.3 稀有鮈鯽ER-LBD序列的獲取

對稀有鮈鯽雌激素受體的cDNA序列全長進行conserved domain BLAST分析，找到其LBD區(qū)域。對稀有鮈鯽肝臟進行總RNA提取，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用RT-PCR獲取目的基因ERα、ERβ1和ERβ2的LBD序列，引物序列為ERαForward 5’-GCTCGATTCCGCAGTCTCAA-3’，ERαReverse 5’-ACAGCGGCACTCGATTCTTA-3’；ERβ1 Forward 5’-GATGTCACTCACCACCCTCG-3’，ERβ1 Reverse 5’-TCCAAACCAGAGCGTCAGTC-3’；ERβ2 Forward 5’-ACTAATCGCTCGCCTCATGG-3’，ERβ2 Reverse 5’-GGGTGATTAACAGACCGCCA-3’。

1.4 靶質(zhì)粒的提取純化與鑒定

10 μL靶質(zhì)粒pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD、pGBKT7-ERβ2-LBD轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，氨芐青霉素或卡納青霉素抗性篩選陽性克隆，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒并純化。0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，同時進行序列測定，測序引物為pGBKT7通用引物。

1.5 構(gòu)建雙雜交熒光酵母

挑取新鮮培養(yǎng)的酵母Y187-Luc菌株單菌落，在25 mL YPDA培養(yǎng)基中30 ℃振蕩培養(yǎng)到對數(shù)生長期后(600 nm處的吸光度值為0.4～0.6)，根據(jù)clontech酵母轉(zhuǎn)化試劑盒將pGBKT7-ERα-LBD質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染至酵母細胞Y187-Luc，構(gòu)建ERα-GRIP1雙雜交酵母，涂布在SD/-His/-Trp/-Leu營養(yǎng)缺陷型的選擇性固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)2～4 d，挑取能在選擇性培養(yǎng)基生長的單菌落接種于SD/-His/-Trp/-Leu液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)過夜，第2天部分酵母添加15%的無菌甘油后-80 ℃冷凍保存。相同的方法將pGBKT7-ERβ1-LBD質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1質(zhì)粒，pGBKT7-ERβ2-LBD質(zhì)粒和pGAD424-GRIP1質(zhì)粒同時轉(zhuǎn)染至酵母細胞Y187-Luc構(gòu)建ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1雙雜交酵母。

1.6 熒光素酶活性的測定

為了選擇對數(shù)生長期的酵母，調(diào)節(jié)菌液在600 nm處吸光值為0.75，在無菌條件下，取995 μL加入5 μL不同梯度的E2和二甲基亞砜(DMSO)，混勻成暴露培養(yǎng)液。將200 μL暴露培養(yǎng)液加入無菌的96孔板中，800 r·min-1、30 ℃下振蕩培養(yǎng)4 h，測定OD600 nm(GENios酶標儀，奧地利，Tecan)。從培養(yǎng)板中取100 μL菌液加入100 μL用檸檬酸-檸檬酸鈉(pH為3.0)溶解的0.05 mmol·L-1的D-熒光素置于檢測白板中，檢測熒光值。

1.7 數(shù)據(jù)處理

對于標準物質(zhì)E2對ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1雙雜交酵母的劑量-效應曲線，采用Origin軟件對相對熒光強度與E2濃度進行四參數(shù)的Logistic回歸擬合，得出半數(shù)效應濃度(EC50)值。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 pGBKT7-ER-LBD誘餌質(zhì)粒的鑒定

將構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD進行5’EcoRI-3’SalI酶切測序驗證，皆為約1 000 bp的載體片段(圖1)，具體分別為981、825和960 bp的片段。同時對質(zhì)粒的測序結(jié)果進一步證實，上述質(zhì)粒正確插入了稀有鮈鯽的ERα-LBD、ERβ1-LBD和ERβ2-LBD基因片段，插入方向及閱讀框正確。

圖1 pGBKT7-ERα-LBD、pGBKT7-ERβ1-LBD和pGBKT7-ERβ2-LBD誘餌質(zhì)粒的鑒定Fig. 1 Identification of the bait plasmid of pGBKT7-ERα-LBD, pGBKT7-ERβ1-LBD and pGBKT7-ERβ2-LBD

2.2 稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母劑量-效應關系的建立

將稀有鮈鯽ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1雙雜交熒光酵母暴露到不同濃度的E2中，檢測誘導產(chǎn)生的熒光素酶活性，建立了E2對熒光素酶活性誘導的劑量-效應關系曲線(圖2)。結(jié)果表明，E2對稀有鮈鯽ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1雙雜交熒光酵母的熒光素酶活性誘導均存在明顯的劑量-效應關系，最大效應濃度分別為：5×10-9、5×10-10和7.5×10-10mol·L-1；半數(shù)效應濃度(EC50)值分別為1.98×10-9、1.77×10-10和3.52×10-10mol·L-1。本實驗構(gòu)建的雙雜交熒光酵母與已報道的E2在重組人雌激素受體ERα雙雜交酵母系統(tǒng)中檢測的EC50(7.3×10-11mol·L-1)結(jié)果類似[9]，表明本實驗構(gòu)建的稀有鮈鯽不同ER亞型的重組熒光雙雜交酵母對E2具有較好的靈敏度，也初步證明稀有鮈鯽不同ER亞型的雙雜交熒光酵母測評體系構(gòu)建成功。有文獻報道，中國的揚子江、丹水河和太湖中的E2濃度分別可以達到3.8、66.2和15.5 ng·L-1，而類雌激素物質(zhì)在環(huán)境相關濃度(ng·L-1)下可以干擾魚類的內(nèi)分泌系統(tǒng)，甚至導致雄魚的雌性化[10]。故可以將本實驗構(gòu)建的稀有鮈鯽不同ER亞型的重組熒光雙雜交酵母應用于環(huán)境水體雌激素活性的檢測，通過評估對模式生物稀有鮈鯽ER的影響分析水體中內(nèi)分泌干擾物的潛在環(huán)境風險，以期為水質(zhì)保障和污染治理提供重要依據(jù)。

圖2 17β-雌二醇(E2)對稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母熒光素酶活性誘導的劑量-效應關系Fig. 2 The induction dose-response curves of rare minnow different ER subtype recombinant fluorescent two-hybrid yeasts by 17β-Estradiol (E2)

比較3株轉(zhuǎn)入稀有鮈鯽不同ER亞型的重組熒光雙雜交酵母對E2的劑量-效應關系，發(fā)現(xiàn)ERα-GRIP1的EC50>ERβ2-GRIP1的EC50>ERβ1-GRIP1的EC50，表明稀有鮈鯽不同亞型的ER-LBD對E2的親和力及響應存在差異，ERβ特別是ERβ1對E2的應答更為靈敏。本實驗得出的E2誘導稀有鮈鯽ERα和ERβ轉(zhuǎn)錄活性的差異與其他硬骨魚類的相關報道結(jié)果一致，利用GAL4-ER-LBD的融合蛋白和ER嵌合蛋白的相互作用量化ER-LBD的反式激活發(fā)現(xiàn)，青鳉、三刺魚、斑馬魚、鯉魚和擬鯉的ERβ-LBD比ERα-LBD對E2敏感，其中ERβ1較ERβ2對E2更為敏感[1]。根據(jù)nER途徑中不同分子機制開發(fā)的檢測方法也得出類似的結(jié)果，Tohyama等[11]采用常規(guī)的含有ERE報告基因的轉(zhuǎn)錄激活實驗發(fā)現(xiàn)，多鰭魚和龍魚的ERβ對E2的轉(zhuǎn)錄應答相對ERα較為敏感(多鰭魚ERβ的EC50=1.12×10-10mol·L-1，ERα的EC50=3.88×10-10mol·L-1；龍魚ERβ的EC50=8.98×10-11mol·L-1，ERα的EC50=4.13×10-10mol·L-1)，對于鰻魚的ERβ1和ERβ2，ERβ1較ERβ2對E2更為敏感(ERβ1的EC50=3.93×10-11mol·L-1，ERβ2的EC50=7.64×10-11mol·L-1)。以上研究表明，硬骨魚類的不同ER亞型對配體誘導的轉(zhuǎn)錄激活具有差異性，稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母可以應用于分析不同ER亞型與配體間相互作用的差異。

2.3 稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母專一性的檢測

將稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母暴露于不同人體激素包括17β-雌二醇(E2)、雙氫睪酮(DHT)、9-順維甲酸(9-cisRA)、三碘甲狀腺原氨酸(T3)和孕酮(PG)中，通過檢測熒光素酶活性，考察稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母對不同人體激素的響應情況，結(jié)果在10-6～10-11mol·L-1濃度范圍內(nèi)，T3、DHT、PG和9-cisRA對3株稀有鮈鯽重組熒光雙雜交酵母的熒光素酶活性幾乎沒有誘導，而E2對熒光素酶活性存在明顯誘導(圖3)。因此，E2對稀有鮈鯽ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1熒光雙雜交酵母存在專一性誘導。

圖3 不同激素誘導稀有鮈鯽不同ER亞型重組熒光雙雜交酵母的專一性檢測注：E2為17β-雌二醇，DHT為雙氫睪酮，9-cis RA為9-順維甲酸，T3為三碘甲狀腺原氨酸，PG為孕酮；* 表示P<0.05，與對照組相比。Fig. 3 Specificity detection of different ER subtypes of rare minnow different ER subtype recombinant fluorescent two-hybrid yeasts induced by different hormonesNote: E2 stands for 17β-estradiol; DHT stands for dihydrotestosterone; 9-cis RA stands for 9-cis retinoic acid; T3 stands for triiodothyronine; PG stands for progesterone; * means P <0.05, compared with the control.

綜上所述，所構(gòu)建的稀有鮈鯽ERα-GRIP1、ERβ1-GRIP1和ERβ2-GRIP1重組熒光雙雜交酵母均能選擇性地檢測類雌激素物質(zhì)，E2對熒光素酶活性的誘導均存在明顯的劑量-效應關系且它們對E2的親和力和響應具有差異性，敏感程度排序為：ERβ1-LBD>ERβ2-LBD>ERα-LBD。結(jié)果表明，3株重組熒光雙雜交酵母有助于理解稀有鮈鯽不同ER亞型功能的差異和在雌激素信號轉(zhuǎn)導中的作用，而且可以將3株重組熒光雙雜交酵母應用于識別EDCs中的類雌激素物質(zhì)，研究稀有鮈鯽不同ER亞型的LBD對EDCs的敏感性，從而分析魚類接觸EDCs的潛在風險；也可以將其應用于環(huán)境水體雌激素活性的風險評價，以期為水質(zhì)保障和污染治理提供重要依據(jù)。