付凌萌，吳 逸，王 菁，魏 婕，王少康，孫桂菊

（東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，江蘇 南京 210009）

黃曲霉素素B1（aflatoxin B1，AFB1）是常見的污染農(nóng)作物的真菌毒素，廣泛存在于谷物、油籽、堅(jiān)果和香料中，其穩(wěn)定性好，故難以在食品加熱加工過(guò)程中被降解[1]。AFB1暴露可在器官中產(chǎn)生諸多不良反應(yīng)，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將其劃分為一類致癌物[2]。食管作為上消化道的一部分，不可避免地會(huì)接觸AFB1這類外源性化學(xué)毒物，進(jìn)而受到毒害作用。研究表明，AFB1污染食物是食管癌可能的危險(xiǎn)因素[3-4]。

而相關(guān)研究顯示，木犀草素可抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生[5]，對(duì)黃曲霉毒素的毒性有抑制作用[6]。木犀草素（luteolin，LUT）是天然的黃酮類化合物，多以糖苷形式廣泛存在于芹菜、青椒等蔬菜以及菊花、金銀花等中草藥中[7]。Resende等[8]研究多種黃酮類化合物對(duì)不同誘變劑的抗突變性，只有木犀草素對(duì)包括黃曲霉毒素在內(nèi)的多種直接或間接誘變劑的誘變作用都具有保護(hù)作用，該保護(hù)作用可能與抑制活性物質(zhì)的形成并防止細(xì)胞凋亡和DNA損傷有關(guān)[9]。木犀草素還可以保護(hù)食管，有抗食管腫瘤作用[10-11]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，葉酸（folic acid，F(xiàn)A）也經(jīng)可減弱AFB1的毒害作用[12-13]。體外實(shí)驗(yàn)證明葉酸可抵抗AFB1的致突變性[14]，葉酸作為人體必需的水溶性B族維生素之一，參與機(jī)體重要的生理活動(dòng)，與細(xì)胞增殖、組織生長(zhǎng)及機(jī)體發(fā)育密切相關(guān)。由于真核細(xì)胞本身不能夠合成葉酸，體外獲得充足的葉酸在機(jī)體發(fā)育的過(guò)程中于是變得尤為重要。FA也與食管癌的發(fā)生息息相關(guān)，多個(gè)研究表明FA是食管癌的保護(hù)因素[15-16]。有研究將木犀草素與葉酸綴合到超順磁性氧化鐵納米顆粒，發(fā)現(xiàn)其對(duì)癌細(xì)胞有抑制作用，有望成為抗癌劑[17]，由二者的抗腫瘤效應(yīng)聯(lián)想到二者對(duì)AFB1共同的抗毒效應(yīng)。

故考慮到木犀草素與葉酸對(duì)黃曲霉毒素均有抑制作用，且二者均可保護(hù)食管不受危害，本研究用木犀草素與葉酸單獨(dú)及聯(lián)合干預(yù)經(jīng)AFB1染毒的人正常食管上皮細(xì)胞（human normal esophageal epithelial cells，HEEC），檢測(cè)細(xì)胞增殖、周期、凋亡及亞甲基四氫葉酸還原酶（5,10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）蛋白表達(dá)水平及基因啟動(dòng)子CpG區(qū)的甲基化狀態(tài)，闡明木犀草素和葉酸對(duì)AFB1的細(xì)胞毒性及表觀遺傳改變的影響，為二者協(xié)同降低AFB1對(duì)食管的毒性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常食管上皮細(xì)胞 上海中科院細(xì)胞庫(kù)；AFB1（純度≥98%） 德國(guó)Sigma公司；LUT（純度≥98%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FA（純度≥97%）、DMEM不完全高糖培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司；雙抗（青霉素、鏈霉素）、0.25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）胰蛋白酶溶液、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS） 美國(guó)Hyclone公司；特級(jí)胎牛血清 美國(guó)Clark公司；二甲基亞砜 南京博全科技有限公司；細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8） 上海翊圣生物公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒和Annexin V/碘化丙啶（propidium iodide，PI）雙染凋亡檢測(cè)試劑盒 南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、HRP標(biāo)記山羊抗兔 武漢谷歌生物科技；MTHFR抗體美國(guó)Abcam公司；GAPDH 碧云天生物技術(shù)有限公司；DNA提取試劑盒、DNA染料 北京百泰克生物技術(shù)有限公司；NaHSO3美國(guó)Zymo公司；引物 美國(guó)Thermo公司；EpiTYPER? Reagent Kit 美國(guó)Agena公司。

1.2 儀器與設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱 美國(guó)Napco公司；RT-6000酶標(biāo)分析儀 美國(guó)Rayto公司；IX51倒置相差顯微鏡 日本Olympus公司；Centrifuge小型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)德國(guó)Eppendorf公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)美國(guó)Thermo公司；脫色搖床和電泳儀 北京六一儀器廠；垂直電泳槽 美國(guó)Bio-Rad公司；Inage Master VDS凝膠自動(dòng)成像儀 瑞典Pharmacia公司；核酸自動(dòng)提取儀北京百泰克生物技術(shù)有限公司；384-well SpectroCHIP?bioarray芯片、MassARRAY Nanodispenser點(diǎn)樣機(jī)、MassARRAY Analyzer 4.0質(zhì)譜儀 美國(guó)Agena公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HEEC接種于完全培養(yǎng)液（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM不完全高糖培養(yǎng)基）中，置于37 ℃、5% CO2恒溫飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，每天換液一次，傳代2～3 d一次。細(xì)胞狀態(tài)良好，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（融合度達(dá)80%）時(shí)即可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 AFB1對(duì)HEEC活力的影響

用CCK-8法檢測(cè)AFB1染毒對(duì)細(xì)胞活力的影響，待細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，胰酶消化離心，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)6×104個(gè)/mL細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔懸液100 μL。培養(yǎng)24 h后分別加入AFB1濃度為0（空白對(duì)照組）、13、25、50、100、200 μmol/L的培養(yǎng)液染毒，每組設(shè)5 個(gè)平行孔。取3 板分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔貼壁加入10 μL CCK-8工作液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3.5 h，終止培養(yǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的OD值。細(xì)胞抑制率根據(jù)下式計(jì)算。

1.3.3 LUT與FA對(duì)AFB1染毒的HEEC的干預(yù)

取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，分為7 組：空白對(duì)照組、染毒組（200 μmol/L AFB1）、LUT干預(yù)組（AFB1+LUT組：200 μmol/L AFB1+160 μmol/L LUT溶液）、FA干預(yù)組（AFB1+FA1組：200 μmol/L AFB1+20 μmol/L FA溶液；AFB1+FA2組：200 μmol/L AFB1+200 μmol/L FA溶液）、聯(lián)合干預(yù)組（AFB1+LUT+FA1組：200 μmol/L AFB1+160 μmol/L LUT+20 μmol/L FA；AFB1+LUT+FA2組：200 μmol/L AFB1+160 μmol/L LUT+200 μmol/L FA的溶液），各組HEEC處理24 h后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，每組重復(fù)測(cè)3 次。

1.3.3.1 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力

同1.2.2節(jié)配成細(xì)胞懸液后計(jì)數(shù)6×104個(gè)/mL細(xì)胞接種于96 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24 h后加入上述7 組培養(yǎng)液，每組設(shè)5 個(gè)平行孔。取3 板分別培養(yǎng)24 h后，后具體操作同1.2.2節(jié)。

1.3.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

各組處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，PBS洗滌2 遍（2 000 r/min離心5min）并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL，留少量上清液與細(xì)胞沉淀混勻，滴加體積分?jǐn)?shù)70%乙醇迅速振搖混勻，于4 ℃固定過(guò)夜。2 000 r/min離心細(xì)胞5 min，吸棄上清液，用1 mL PBS重懸細(xì)胞，再離心洗滌細(xì)胞一次，吸棄上清液，加入100 μL RNase A 37 ℃水浴 30 min，再加入400 μL PI染色混勻，置暗處30 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.3.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

各處理組培養(yǎng)24 h后用不含EDTA的胰酶消化收集不同處理的細(xì)胞。PBS洗滌2 遍（2 000 r/min離心5 min）并調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，加入500 μL的結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL PI混勻，置暗處15 min后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率。

1.3.3.4 Western Blot檢測(cè)MTHFR蛋白表達(dá)情況

參照Li Chao等[18]的方法，略作改動(dòng)。各處理組培養(yǎng)24 h后，PBS沖洗細(xì)胞3 次，加裂解液裂解細(xì)胞3～5 min，收集冰浴30 min，期間反復(fù)吹打以確保細(xì)胞裂解完全。4 ℃ 12 000×g離心5 min，吸取上清液，用BCA法測(cè)定總蛋白濃度，然后配制8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）分離膠及5%濃縮膠，上樣后進(jìn)行SDS-PAGE分離、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜過(guò)夜，用封閉液（5% BCA、TPBS配制）封閉，室溫下脫色搖床緩慢搖動(dòng)2 h。MTHFR抗體（1∶1 000）4 ℃脫色搖床緩慢孵育過(guò)夜。次日TBST清洗聚偏氟乙烯（poly(vinylidene fluoride)，PVDF）膜3 次，每次10 min。加HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶3 000），室溫下脫色搖床孵育30 min后，用TBST清洗PVDF膜3 次，每次10 min，配制化學(xué)發(fā)光混合液，浸沒(méi)PVDF膜后適時(shí)曝光，條帶采用Image J軟件進(jìn)行半定量灰度值分析。

1.3.3.5 MassARRAY甲基化檢測(cè)HEEC的MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

參照Z(yǔ)hu Yunyun等[19]的方法，略作改動(dòng)。通過(guò)NCBI獲得MTHFR基因序列及其啟動(dòng)子，利用CpG島在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站http∶//www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/預(yù)測(cè)其基因啟動(dòng)子區(qū)潛在的CpG島，該段序列相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置為4 812～5 405 bp，長(zhǎng)度為594 bp，共33 個(gè)單位信息，覆蓋49 個(gè)位點(diǎn)（圖1）。用EpiDesigner軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物（5’端：AGGAAGAGAGGGAAGTGGTAGTTATTGGGAGTTATATT；3’端：CAGTAATA CGACTCACTATAGGGAGAAGGCTACAACACAAAAACCCCCTACAC）（表1）。用DNA提取試劑盒提取各處理組細(xì)胞DNA，用NaHSO3處理待檢測(cè)DNA樣品。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法擴(kuò)增目的基因片段，擴(kuò)增程序：94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃3 min。蝦堿性磷酸酶（shrimp alkaline phosphatase，SAP）混合液去除反應(yīng)體系中游離的核苷酸，將PCR/SAP反應(yīng)產(chǎn)物混合并在37 ℃孵育，進(jìn)行3 h的體外轉(zhuǎn)錄和RNase A消化，隨即進(jìn)行芯片點(diǎn)樣，用MALDI-TOF分析點(diǎn)樣后的芯片，最后用EpiTYPERTM軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估和分析。

圖1 MTHFR基因的CpG位點(diǎn)Fig. 1 CpG sites of MTHFR gene

表1 MTHFR引物信息Table 1 Information about primers used for MTHFR amplification

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 19.0軟件，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，事后兩兩比較采用Dunnett's t檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異水準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 AFB1對(duì)HEEC活力的影響

圖2 AFB1作用于HEEC不同時(shí)間的抑制率Fig. 2 Inhibition rates of AFB1 against HEEC at different culture times

由圖2可知，HEEC經(jīng)不同濃度的AFB1分別處理24、48 h和72 h后，細(xì)胞活力均被抑制。1～200 μmol/L范圍內(nèi)，細(xì)胞抑制率隨著AFB1濃度的增加而升高，100、200 μmol/L AFB1處理組細(xì)胞抑制率極顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.01），AFB1可以抑制HEEC的增殖，抑制率呈劑量依賴性升高，與Parveen等[20]研究AFB1對(duì)犬腎細(xì)胞毒性作用結(jié)果一致。同一濃度不同處理時(shí)間，AFB1低濃度（13、25、50 μmol/L）時(shí)抑制率與時(shí)間成反比，可能是細(xì)胞自我應(yīng)激保護(hù)作用導(dǎo)致的[21]。而100、200 μmol/L AFB1處理組細(xì)胞的抑制率則隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而升高。綜合考慮劑量及處理時(shí)間對(duì)AFB1的影響，選擇200 μmol/L建立細(xì)胞損傷模型。

2.2 LUT及FA對(duì)AFB1染毒的HEEC的影響

2.2.1 LUT及FA對(duì)AFB1染毒細(xì)胞增殖的影響

圖3 LUT及FA對(duì)AFB1染毒HEEC增殖抑制的影響Fig. 3 Effects of LUT and FA on proliferation inhibition of AFB1-treated cells

如圖3所示，AFB1+LUT、AFB1+LUT+FA1及AFB1+LUT+FA2組細(xì)胞抑制率顯著低于染毒組（P＜0.05），而單獨(dú)使用FA干預(yù)（AFB1+FA1組、AFB1+FA2組），效果不顯著（P＞0.05）。AFB1+LUT組與AFB1+LUT+FA1組及AFB1+LUT+FA2組細(xì)胞抑制率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在用LUT及FA干預(yù)后，含有LUT的組別抑制率均明顯降低，提示LUT降低了AFB1對(duì)HEEC增殖的抑制，對(duì)AFB1抑制增殖有保護(hù)作用。

2.2.2 LUT及FA對(duì)AFB1染毒的HEEC細(xì)胞周期的影響

圖4 LUT及FA對(duì)AFB1染毒的HEEC細(xì)胞周期的影響Fig. 4 Effects of LUT and FA on cell cycle of HEECs with AFB1 exposure

由圖4a可知，AFB1可誘導(dǎo)HEEC周期發(fā)生改變，G0/G1期細(xì)胞比例升高（P＜0.05），S期細(xì)胞比例降低（P＜0.05），說(shuō)明AFB1將HEEC阻滯于G0/G1期，抑制細(xì)胞分裂增殖，與Liu Caixia等[22]的研究結(jié)果一致。由圖4b可知，與染毒組相比，LUT干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組G0/G1期細(xì)胞比例較染毒組顯著降低（P＜0.05），S期的細(xì)胞所占比例顯著升高（P＜0.05），減少了AFB1對(duì)細(xì)胞G0/G1期的阻滯作用。AFB1+LUT組與AFB1+LUT+FA1組及AFB1+LUT+FA2組各細(xì)胞周期占比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說(shuō)明LUT可減少G0/G1期的細(xì)胞，增加S期的細(xì)胞，減輕AFB1對(duì)細(xì)胞周期的阻滯作用。

2.2.3 LUT及FA對(duì)AFB1染毒HEEC細(xì)胞凋亡的影響

圖5 LUT及FA對(duì)AFB1染毒的HEEC細(xì)胞凋亡的影響Fig. 5 Effects of LUT and FA on HEEC apoptosis induced by AFB1

由圖5a可知，分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染毒組細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），表明AFB1促進(jìn)HEEC凋亡。由圖5b可知，LUT干預(yù)組、聯(lián)合干預(yù)組細(xì)胞凋亡率雖然高于空白對(duì)照組（P＜0.05），但顯著低于AFB1染毒組（P＜0.05），說(shuō)明LUT及FA抑制了AFB1的促凋亡作用。雖然FA單獨(dú)干預(yù)后的細(xì)胞凋亡率與染毒組無(wú)顯著差異，但聯(lián)合LUT后顯著抑制了AFB1的促凋亡作用，且該聯(lián)合效應(yīng)強(qiáng)于LUT單獨(dú)干預(yù)組（P＜0.05）。

2.2.4 Western Blot檢測(cè)MTHFR蛋白表達(dá)結(jié)果

由圖6a可知，AFB1染毒可以上調(diào)HEEC的MTHFR蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。經(jīng)LUT干預(yù)相比染毒組可下調(diào)細(xì)胞MTHFR蛋白表達(dá)（P＜0.05）。由圖6b可知，用FA進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)FA增強(qiáng)染毒細(xì)胞MTHFR蛋白的表達(dá)，20 μmol/L的FA干預(yù)能顯著上調(diào)MTHFR蛋白表達(dá)（P＜0.05）；LUT聯(lián)用不同濃度的FA干預(yù)能顯著減弱AFB1對(duì)MTHFR蛋白表達(dá)的影響，作用強(qiáng)于LUT干預(yù)組（P＜0.05）。

圖6 LUT及FA對(duì)經(jīng)AFB1染毒的HEEC的MTHFR蛋白表達(dá)影響Fig. 6 Effects of LUT and FA on the expression of MTHFR protein in AFB1-induced HEECs

2.2.5 MassARRAY甲基化檢測(cè)HEEC的MTHFR基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況

圖7 MassARRAY甲基化檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Results of MassARRAY methylation

表2 MassARRAY甲基化水平定量結(jié)果（n=3）Table 2 Quantitative results of MassARRAY methylation level (n= 3)

圖8 甲基化水平升高的CpG單位的MassARRAY甲基化檢測(cè)結(jié)果Fig. 8 Results of MassARRAY methylation for CpG units with elevated methylation levels

由表2及圖7、8可知，本次共獲得了29 個(gè)有效單位信息，包括43 個(gè)位點(diǎn)。這些CpG單位的甲基化水平范圍是0.00～74.00%，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，除CpG_6.7、CpG_16、CpG_35、CpG_42位點(diǎn)外，其余位點(diǎn)甲基化水平在染毒組和空白對(duì)照組中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。分析這幾個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平，結(jié)果顯示染毒組甲基化水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05）。比較CpG_6.7位點(diǎn)的甲基化水平，染毒組細(xì)胞甲基化水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），200 μmol/L FA組的甲基化水平顯著低于染毒組（P＜0.05）；對(duì)于CpG_35位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)LUT組及LUT聯(lián)用200 μmol/L FA干預(yù)組的甲基化水平顯著低于染毒組（P＜0.05），與空白對(duì)照組接近（P＞0.05）；對(duì)于CpG_16、CpG_42位點(diǎn)，各干預(yù)組干預(yù)效果顯著（P＜0.05）。分析各組4 個(gè)位點(diǎn)總的甲基化水平，染毒組細(xì)胞甲基化水平顯著高于空白對(duì)照組（P＜0.05），各干預(yù)組甲基化水平均相對(duì)染毒組降低（P＜0.01）。

3 討 論

AFB1具有急性毒性、慢性毒性及蓄積性致癌作用[23]，伊朗一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)AFB1污染是食管癌可能的危險(xiǎn)因素，食管癌高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)小麥粉中AFB1含量為（0.80±1.14） ng/g，顯著高于低風(fēng)險(xiǎn)的（0.26±0.31）ng/g（P＝0.003）[3]。同樣的，在對(duì)江蘇淮安食管癌高發(fā)區(qū)和山東桓臺(tái)食管癌低發(fā)區(qū)進(jìn)行的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，食管癌高發(fā)區(qū)淮安地區(qū)玉米樣品中AFB1含量為13.5 μg/kg，遠(yuǎn)高于食管癌低發(fā)區(qū)桓臺(tái)的1.3 μg/kg（P＜0.05），而根據(jù)食物頻率法調(diào)查AFB1的膳食攝入量，淮安地區(qū)為1.723（0.242～49.772）μg/kg，桓臺(tái)為0.397（0.267～1.218）μg/kg，食管癌高發(fā)區(qū)的外暴露量遠(yuǎn)高于低發(fā)區(qū)（P＜0.05），說(shuō)明食管癌的發(fā)生與AFB1有關(guān)[4]。因此，探討AFB1對(duì)食管細(xì)胞的毒性作用對(duì)AFB1毒性的防控有重要意義。

多個(gè)研究表明由于細(xì)胞種類不同，AFB1對(duì)細(xì)胞周期的影響體現(xiàn)在不同階段，導(dǎo)致HepG2細(xì)胞停滯于S期和G2期[24]，增加人支氣管上皮細(xì)胞中S期細(xì)胞數(shù)量[25]。細(xì)胞周期的阻滯導(dǎo)致細(xì)胞增殖的抑制[26]，故本研究中AFB1通過(guò)將細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。而LUT的干預(yù)可減少G0/G1期的細(xì)胞，增加S期的細(xì)胞，減輕AFB1對(duì)周期的阻滯作用，從而相對(duì)增加細(xì)胞增殖。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，它的啟動(dòng)可通過(guò)兩種基本途徑：外在和內(nèi)在途徑。外在途徑由死亡受體啟動(dòng)，內(nèi)在途徑由線粒體或溶酶體透化介導(dǎo)[27]。AFB1誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與線粒體功能受損有關(guān)[28-29]。有研究表明，AFB1通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，減少細(xì)胞線粒體含量和增強(qiáng)Bax、caspase-3、p53表達(dá)導(dǎo)致精子細(xì)胞線粒體依賴性細(xì)胞凋亡[30]。而也有研究顯示，LUT可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡等作用減輕乙酰氨基酚誘導(dǎo)的 L02 肝細(xì)胞損傷[31]。本實(shí)驗(yàn)中AFB1增強(qiáng)了HEEC的凋亡，LUT以及LUT聯(lián)合FA可以減少這種凋亡，且兩者聯(lián)合作用強(qiáng)于LUT單獨(dú)作用。表明LUT及二者聯(lián)合可以通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡保護(hù)HEEC。

MTHFR是葉酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶[32]，它將5,10-亞甲基四氫葉酸不可逆地催化轉(zhuǎn)化為5-甲基四氫葉酸，而后者又是循環(huán)葉酸的主要形式，它將甲硫氨酸轉(zhuǎn)換為S-腺苷甲硫氨酸，S-腺苷甲硫氨酸用于細(xì)胞內(nèi)各的甲基化反應(yīng)的供體，特別是DNA甲基化[33]。而膳食AFB1暴露可能導(dǎo)致DNA甲基化的改變[34]。DNA甲基化在基因調(diào)控中起重要作用，如參與基因表達(dá)，影響染色質(zhì)構(gòu)型和DNA的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白質(zhì)的結(jié)合，導(dǎo)致X染色體失活，致衰老和致癌作用[35]。DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，其包括在CpG二核苷酸的胞嘧啶中添加甲基。這些CpG二核苷酸主要位于CpG島上，其主要聚集在蛋白質(zhì)編碼基因的啟動(dòng)子區(qū)域周圍[36]。有研究表明MTHFR基因與AFB1在癌癥形成過(guò)程中可能有著密切聯(lián)系[37]，且其甲基化與食管腫瘤發(fā)生密切相關(guān)[38]，故本研究在AFB1對(duì)人食管上皮細(xì)胞的染毒及LUT、FA的干預(yù)實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)了MTHFR基因啟動(dòng)子CpG區(qū)的甲基化狀態(tài)，以闡明AFB1所致的表觀遺傳改變以及LUT、FA對(duì)該表觀遺傳改變的影響。

MassARRAY是近年來(lái)新出現(xiàn)的DNA甲基化定量檢測(cè)方法。它比亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR（BSP）能更有效地反映低甲基化區(qū)域的真實(shí)甲基化水平，它可以檢測(cè)到低至5%的甲基化水平[39]，故而能更準(zhǔn)確的定量甲基化水平。本研究采用該方法檢測(cè)了MTHFR啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)AFB1染毒后多個(gè)位點(diǎn)甲基化水平高于空白對(duì)照組，而經(jīng)LUT及FA干預(yù)后，甲基化水平有所下降。甲基化水平的升高與諸多疾病的發(fā)生有關(guān)，特別是癌癥。Xia Fada等[40]的研究13 種癌組織miR-204啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)13 種癌組織中該基因甲基化率均高于正常組織。MTHFR甲基化水平與哈薩克族食管癌的相關(guān)性研究中，病例組MTHFR基因的甲基化率高于空白對(duì)照組（P＜0.05），提示MTHFR基因的甲基化與食管癌的發(fā)生有密切的關(guān)系[41]。本研究用AFB1染毒HEEC，MTHFR甲基化升高，表明MTHFR在AFB1對(duì)食管的作用中起到了一定的作用。DNA甲基化后，基因序列保持不變，但不同的甲基化表達(dá)水平可能會(huì)起到不同的作用。這種修飾反應(yīng)經(jīng)常發(fā)生在富含CG序列的二核苷酸中，其結(jié)構(gòu)與支持染色體，胚胎發(fā)育，細(xì)胞記憶和衰老的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。研究DNA甲基化在腫瘤風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)防，早期診斷和預(yù)后發(fā)展的臨床評(píng)價(jià)有重要的指導(dǎo)作用[42]。本研究FA雖在周期凋亡中未對(duì)AFB1染毒產(chǎn)生的相關(guān)變化，在MTHFR高甲基化上和LUT體現(xiàn)了同樣的干預(yù)作用，且聯(lián)合作用較強(qiáng)，體現(xiàn)了二者在AFB1的毒性作用中的抑制作用，一定程度上阻止了食管毒性向癌癥的轉(zhuǎn)化。

本研究結(jié)果顯示AFB1上調(diào)了MTHFR的蛋白表達(dá)，LUT可以下調(diào)MTHFR蛋白的上調(diào)，而FA則是相反的作用，和LUT聯(lián)合后該相反的作用消失。研究表明，MTHFR基因多態(tài)性可以影響MTHFR的活性及穩(wěn)定性，進(jìn)而影響葉酸的正常代謝[41]。參考該研究，推測(cè)MTHFR的高甲基化影響蛋白表達(dá)，甲基化水平升高的MTHFR蛋白導(dǎo)致葉酸代謝紊亂，從而導(dǎo)致葉酸干預(yù)的反向作用，而聯(lián)用LUT則糾正了其對(duì)葉酸代謝的影響，對(duì)MTHFR蛋白的上調(diào)不再是繼續(xù)上調(diào)而是下調(diào)，使葉酸的正向干預(yù)作用得以顯現(xiàn)。而Kim等[43]的研究也證明葉酸有雙重調(diào)節(jié)作用。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)AFB1抑制HEEC的增殖，阻滯其周期，促進(jìn)凋亡，LUT對(duì)這些毒性作用有相應(yīng)的改善；在AFB1可引起MTHFR高甲基化，LUT與FA及二者聯(lián)合均可降低升高的甲基化水平，對(duì)該表觀遺傳改變具有調(diào)節(jié)作用，體現(xiàn)了抗AFB1毒性作用；MTHFR高甲基化的同時(shí)，蛋白表達(dá)水平也有所上調(diào)，LUT可以減少上調(diào)，改善AFB1對(duì)MTHFR蛋白表達(dá)的影響，而FA體現(xiàn)的是反向調(diào)節(jié)作用，考慮是MTHFR基因高甲基化導(dǎo)致的葉酸代謝紊亂，對(duì)其確認(rèn)及機(jī)制的探討有待進(jìn)一步研究。