席恩澤，趙 曉，崔東影，盛 雪，李夢寒，許曉曦

（東北農業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

嬰兒出生時腸道發(fā)育尚未成熟，腸道免疫發(fā)育緩慢[1]，這使得他們更容易發(fā)生各種并發(fā)癥，包括乳糖不耐受、產后生長受限、感染和壞死性小腸結腸炎等。母乳含有許多生物活性成分，有助于嬰兒腸道生長和發(fā)育，其中重要的一種組分就是乳鐵蛋白[2]。乳鐵蛋白屬于轉鐵蛋白家族，是一種分子質量為78 kDa的非血紅素鐵結合糖蛋白，含有約690 個氨基酸殘基[3]。除了促進腸道細胞生長和發(fā)育外，乳鐵蛋白還具有抗菌、抗真菌、抗病毒、抗菌、抗氧化、抗炎、抗寄生蟲、抗過敏和抗癌特性[4-5]。因此，關于乳鐵蛋白調節(jié)腸道免疫功能的研究近年來受到了學者的廣泛關注。目前，乳鐵蛋白已成為嬰兒配方奶粉的主要功能性添加成分，而針對牛源乳鐵蛋白對嬰兒腸道及免疫的影響尚鮮有探究。迄今為止，母乳喂養(yǎng)是保留乳中免疫蛋白生物活性的最佳方法。但由于各種原因，仍有至少一半的新生兒及嬰兒無法通過母乳喂養(yǎng)獲得相應的營養(yǎng)物質及免疫功能，需要通過配方奶粉及配方乳替代母乳。傳統(tǒng)的配方奶粉及配方乳為了保證產品的安全性必須進行較高溫度的熱處理，從而導致蛋白質變性、維生素損失等問題，并會產生一些美拉德反應產物。此外，熱處理會誘導乳蛋白的變性和聚集，從而改變其生物活性和結構特性[6]。乳鐵蛋白具有熱敏性，其鐵結合能力高度依賴于獨特結構，熱處理可能對其免疫活性產生影響。

熱處理對乳鐵蛋白的結構、鐵結合能力[7]、抑菌功能[8]、促成骨細胞增殖和分化功能[9]的影響是目前研究的熱點。但至今對巴氏殺菌后乳鐵蛋白影響腸道免疫的機制，特別是腸細胞增殖方面的探討仍鮮見報道。因此，本研究旨在探討乳鐵蛋白在常見巴氏殺菌條件下被嬰兒胃腸液進一步水解后的免疫功能，并進一步探究乳鐵蛋白對腸道免疫的作用機制。以期為乳鐵蛋白作為營養(yǎng)添加劑在嬰兒配方食品中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛鮮乳來源乳鐵蛋白 美國Hilmar公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶生物技術公司；大鼠小腸隱窩上皮細胞（IEC-6） NTCC典型培養(yǎng)物保藏中心；DMEM培養(yǎng)基和胰酶 美國Gibco公司；胎牛血清加拿大MULTICELL公司；磷酸鹽緩沖液 北京BioTopped公司；CCK-8試劑盒 南京建成生物工程研究所；細胞周期與細胞凋亡檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、雙抗 上海碧云天生物技術公司；培養(yǎng)細胞/細菌總RNA提取試劑盒 北京天根生化科技有限公司；PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTMKit 大連寶生物工程有限公司；引物 上海生工生物工程股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HF90型CO2培養(yǎng)箱 北京市六一儀器廠；AE-31型倒置顯微鏡 麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；BPG-9070A鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；MHBS-1096A酶標儀 南京DeTie公司；BSA224S分析天平 德國Sartorius公司；DSX-280B高壓滅菌鍋 上海申安公司；3K15高速冷凍離心機 德國Sigma公司；FACSAria流式細胞儀 美國BD公司；Step One Plus實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀美國賽默飛世爾公司。

1.3 方法

1.3.1 乳鐵蛋白加熱處理及實驗分組

準確稱取1 g牛源乳鐵蛋白，溶于10 mL超純水中，置于鋁盒中水浴加熱，加熱條件分別為63 ℃、30 min，72 ℃、15 s和85 ℃、15 s。實驗分為5 組，分別為空白組、未熱處理組、63 ℃/30 min組、72 ℃/15 s組和85 ℃/15 s組。空白組為基礎培養(yǎng)基，未熱處理組為添加不經過熱處理的乳鐵蛋白水解液。

1.3.2 體外模擬嬰兒胃腸道消化

按照文獻[10]所述方法模擬消化環(huán)境，并稍作改動。模擬胃液：用1 mol/L鹽酸調至pH 4，加入蒸餾水定容至100 mL，加入0.8 g胃蛋白酶，然后將1.3.1節(jié)中的乳鐵蛋白液加入模擬胃液。保持37 ℃，在搖床中振蕩孵育1.5 h。模擬腸液：將上述模擬胃液用1 mol/L氫氧化鈉調至pH 6.5，加入6.8 g K2HPO4、1 g膽鹽[11]和1 g胰蛋白酶，繼續(xù)37 ℃恒溫振蕩孵育2 h，85 ℃水浴加熱5 min使酶滅活[12]。

1.3.3 細胞培養(yǎng)

將IEC-6細胞培養(yǎng)于含質量分數5%胎牛血清、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，置于CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.4 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞增殖的影響

將未熱處理組和3 種熱處理組的乳鐵蛋白水解液溶于含質量分數1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，配制不同質量濃度的乳鐵蛋白水解液刺激IEC-6細胞。將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)的細胞調至1×104個/mL，每孔100 μL接種到96 孔培養(yǎng)板中，饑餓處理24 h后，分別添加不同質量濃度的乳鐵蛋白水解液，培養(yǎng)24、48 h后吸除培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含質量分數10% CCK-8的1%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，37 ℃孵育2 h，酶標儀450 nm波長處振蕩60 s測定OD值，比較各組OD值以判斷4 種處理方式的乳鐵蛋白水解液（未熱處理、63 ℃/30 min、72 ℃/15 s和85 ℃/15 s組）作用于細胞的最佳質量濃度。細胞增殖率計算公式如下。

1.3.5 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞周期的影響

將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，細胞濃度為2×105個/mL，饑餓處理，當細胞融合至70%后，加入最佳質量濃度的乳鐵蛋白水解液，分別培養(yǎng)24、48 h后，按照細胞周期試劑盒說明書進行操作，將所收集的細胞置于流式細胞儀進行檢測，并采用ModFit LT軟件進行分析。

1.3.6 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞凋亡的影響

將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)的細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，細胞濃度為1×105個/mL，饑餓處理，當細胞融合至70%后加入最佳質量濃度的乳鐵蛋白水解液，分別培養(yǎng)24、48 h后，按照細胞凋亡試劑盒說明書進行操作，將所收集的細胞置于流式細胞儀進行檢測。

1.3.7 不同條件巴氏殺菌后的乳鐵蛋白水解液對細胞周期相關基因表達的影響

將1.3.3節(jié)所培養(yǎng)的細胞接種于細胞培養(yǎng)皿中，細胞濃度為4×106個/mL，饑餓處理，當細胞融合至80%后，加入最佳質量濃度的乳鐵蛋白水解液進行培養(yǎng)，并按照試劑盒步驟提取細胞RNA、反轉錄cDNA、添加引物。采用兩步法PCR擴增標準程序，擴增反應參數為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40 次。結果采用儀器自帶軟件進行分析，采用2-ΔΔCt法計算[13]。PCR引物如表1所示。

表1 實時熒光定量PCR引物Table 1 Primers used for qPCR

1.4 數據統(tǒng)計與分析

數據均使用Statistix 8軟件進行單因素方差分析，并用Origin 8.5軟件作圖，結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞增殖的影響

實驗初期質量濃度選定范圍為0～1 mg/mL中幾個關鍵點質量濃度。結果顯示細胞增殖率以0.1 mg/mL為分界線，當質量濃度小于0.1 mg/mL時細胞增殖率逐漸增大；當質量濃度大于0.1 mg/mL時細胞增殖率呈現降低趨勢。最終選定最佳質量濃度范圍為0～0.1 mg/mL內幾個關鍵點質量濃度進行實驗，并計算分別培養(yǎng)24、48 h時的細胞增殖率，結果如圖1所示。

圖1 巴氏殺菌后乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞增殖的影響Fig. 1 Effect of lactoferrin hydrolysates on the proliferation of IEC-6 cells

如圖1所示，隨著乳鐵蛋白水解液質量濃度的升高，IEC-6細胞增殖率逐漸升高，且呈劑量依賴，在質量濃度為0.1 mg/mL時細胞增殖率達到最大；當質量濃度在0.1 mg/mL以上時細胞增殖率開始呈現下降趨勢。綜合24 h和48 h細胞增殖率數據來看，與未熱處理的牛源乳鐵蛋白水解液相比，除了63 ℃/30 min組，其他2 種熱處理方式對乳鐵蛋白的免疫活性沒有明顯的破壞作用，加熱并沒有使乳鐵蛋白的免疫活性基團完全失活，4 種處理方式下的乳鐵蛋白水解液最佳增殖質量濃度均為0.1 mg/mL。

2.2 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞周期的影響

細胞周期進程涉及G0期、G1期、S期、G2期和M期。在G0期時細胞靜止、停止分裂。在G1期時，細胞的大小、體積增加，并準備在S期發(fā)生細胞DNA合成與復制。G2期是DNA合成和有絲分裂之間的間隙，確保細胞準備就緒。進入M階段時細胞有序地分裂成兩個子細胞[14]。

細胞周期分布比例通常被認為是細胞存活、生長和增殖的主要參數。為探究3 種巴氏殺菌處理方式下牛源乳鐵蛋白水解液對腸細胞增殖的機制，采用質量濃度為0.1 mg/mL的牛源乳鐵蛋白水解物分別作用于IEC-6細胞24、48 h后，通過流式細胞術分析其對細胞周期的影響及各周期所占比例。

表2 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用24 h對IEC-6細胞周期的影響Table 2 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell cycle of IEC-6 cells incubated for 24 h

表3 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用48 h對IEC-6細胞周期的影響Table 3 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell cycle of IEC-6 cells incubated for 48 h

如表2、3所示，用63 ℃、30 min，72 ℃、15 s和85 ℃、15 s熱處理條件下的乳鐵蛋白水解液處理IEC-6細胞24 h后，與空白組相比，G0/G1期分布比例由85.84%分別降至61.44%、71.28%、67.80%和63.80%；處理48 h后分別從85.11%下降到61.64%、74.61%、73.58%和69.97%，且差異顯著（P＜0.05）。表明牛源乳鐵蛋白通過降低細胞G0/G1期比例來促進腸道細胞增殖。與未熱處理的乳鐵蛋白水解液相比，除85 ℃/15 s組外，其余2 種熱處理方法均顯著降低IEC-6細胞在G2/M+S期的比例（P＜0.05），表明85 ℃、15 s對乳鐵蛋白的免疫活性基團無明顯破壞。

2.3 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對IEC-6細胞凋亡的影響

表4 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用24 h對IEC-6細胞凋亡的影響Table 4 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell apoptosis of IEC-6 cells incubated for 24 h

表5 0.1 mg/mL乳鐵蛋白水解液作用48 h對IEC-6細胞凋亡的影響Table 5 Effect of 0.1 mg/mL lactoferrin hydrolysates on cell apoptosis of IEC-6 cells incubated for 48 h

程序性細胞死亡簡稱細胞凋亡，與許多調節(jié)細胞增殖和組織穩(wěn)態(tài)的生理生長控制機制有關，是細胞死亡的主要形式[15]。如表4、5所示，與空白組相比，經0.1 mg/mL牛源乳鐵蛋白水解液處理24、48 h后，IEC-6細胞凋亡率尤其是晚期凋亡率明顯降低。與未熱處理組相比，3 種巴氏殺菌方式對乳鐵蛋白活性無明顯破壞作用。但隨著實驗時間的延長，乳鐵蛋白水解液抑制細胞凋亡的作用開始減弱。

2.4 巴氏殺菌后的牛源乳鐵蛋白水解液對細胞周期相關基因表達量的影響

由于4 種牛源乳鐵蛋白水解物均可促進IEC-6細胞增殖，本實驗試圖從基因水平闡明這種增殖作用的潛在機制。因作用24、48 h的增殖趨勢相同，本實驗采用0.1 mg/mL牛源乳鐵蛋白水解液刺激IEC-6細胞24 h，通過熒光定量PCR計算細胞周期相關基因表達量以闡明增殖機制。

圖2 巴氏殺菌后乳鐵蛋白水解液對細胞周期相關基因表達量的影響Fig. 2 Effect of lactoferrin hydrolysates on cell-cycle gene expression in IEC-6 cells

如圖2所示，p21是抑制細胞周期進程的重要基因之一[16]，PCR結果顯示，與空白組相比，除63 ℃/30 min組外，在其他3 種乳鐵蛋白水解液作用下，p21表達水平顯著降低（P＜0.05）。Cyclin E1可與其激酶CDK2結合，是調節(jié)細胞從G1期到S期過渡的重要基因[17]。與空白組相比，除63 ℃/30 min組外，cyclin E1基因表達量在其他3 種牛源乳鐵蛋白水解液中均顯著增加（P＜0.05），這表明牛源乳鐵蛋白可推進細胞周期進程。細胞周期蛋白Cyclin B1/CDK1復合物是細胞進入有絲分裂的關鍵調節(jié)因子，大量的底物蛋白質被Cyclin B1/CDK1復合物在進入有絲分裂之前磷酸化，有絲分裂的調節(jié)與Cyclin B1/CDK1復合物的活性有關。PCR結果顯示，與空白組相比，cyclin B1和CDK1基因在種牛源乳鐵蛋白水解液作用下表達水平均升高。結果表明，4 種乳鐵蛋白水解液通過提高cyclin B1、CDK1、cyclin E1基因表達量，降低基因p21表達量，促進細胞增殖。

與未熱處理組相比，除85 ℃/15 s外，其余2 種熱處理方式下的乳鐵蛋白水解液均能顯著降低cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表達水平（P＜0.05），顯著提高p21的表達水平（P＜0.05），抑制細胞周期進程，但抑制作用顯著低于空白組。由此說明巴氏殺菌雖可降低乳鐵蛋白的免疫活性，但并未使其完全失活。

3 討 論

隨著冷鏈基礎設施的完善和“防腐保鮮防熱傷害?；钚浴崩砟畹钠占癧18]，巴氏殺菌乳成為液體乳發(fā)展的必要趨勢。通過對巴氏殺菌乳和超高溫瞬時滅菌乳的比較可知，隨著熱處理強度的增加，乳中的功能性成分如α-乳白蛋白和乳鐵蛋白的含量不斷減少，而巴氏殺菌乳只是輕微的熱處理，在保證衛(wèi)生安全的同時，更多地保留了牛奶中的活性物質[19]。

目前的研究只停留在加熱誘導變性方面，這會使乳中天然蛋白含量減少，但并沒有直接證據表明會使其功能喪失[20]。因此，進一步研究熱處理是否破壞乳中免疫活性蛋白的免疫功能十分必要。另外，關于熱處理對乳鐵蛋白影響的研究雖多，但主要集中于結構[21]、鐵結合能力和抑菌性等，對其免疫活性雖有涉及[22]，但關于腸道免疫活性方面鮮有研究。本研究著眼于腸道免疫，利用體外實驗優(yōu)化工藝參數，為新型乳制品加工提供基礎研究數據。

實驗結果表明，與未熱處理的乳鐵蛋白水解液相比，3 種巴氏殺菌方式并沒有使乳鐵蛋白完全失活，仍可促進IEC-6細胞的增殖。通過提高cyclin B1、CDK1、cyclin E1基因表達量，降低p21基因表達量，增加細胞在G2/M和S期所占比例，推進細胞周期進程，降低細胞凋亡率。本研究結果表明，乳鐵蛋白通過促進腸道細胞增殖調節(jié)腸道免疫。巴氏殺菌可能使乳鐵蛋白的活性基團暴露，使乳鐵蛋白形成一種展開的中間構象，其構象與未經過熱處理的乳鐵蛋白不同，但仍具有生物活性[23]。且嬰兒消化道中的消化液，尤其是胃蛋白酶，不能將乳鐵蛋白完全消化，在嬰兒的小腸中仍存在完整的乳鐵蛋白[24]。乳鐵蛋白被腸道上皮細胞表面的乳鐵蛋白接受器所識別后，進入細胞核并與特定的DNA結合位點結合，調節(jié)DNA的轉錄[25]，從而顯著地促進腸道上皮細胞的增殖。產后早期是新生兒腸胃結構和功能發(fā)育的關鍵時期，乳鐵蛋白可以促進嬰兒腸道上皮細胞的增殖，進而改善嬰兒的消化吸收能力，提高嬰兒腸道免疫活性[2]。

最新研究表明，采用添加乳鐵蛋白的嬰兒配方粉喂養(yǎng)0～4 周健康新生兒，并進行為期1 年的隨訪調查，發(fā)現乳鐵蛋白可降低新生兒患下呼吸道感染尤其是哮喘的概率，且在出生后6 周體質量增長迅速[26]。乳鐵蛋白作為一種多功能免疫蛋白，已被證實在臨床方面具有輔助治療作用，可預防或治療由細菌、真菌等引起的感染[27-28]。新生兒尤其是早產兒免疫系統(tǒng)尚未成熟，適當補充乳鐵蛋白可減少嬰兒促免疫力類藥物的使用，避免給嬰兒肝腎造成負擔。

本研究從嬰兒腸道免疫角度出發(fā)，體外模擬嬰兒腸胃環(huán)境，利用乳鐵蛋白水解液刺激腸道細胞得出最佳劑量，與以往直接使用乳鐵蛋白刺激腸道細胞而忽略體內消化這一重要步驟的做法[29-30]相比更符合人體正常消化代謝規(guī)律。下一步的研究應該以此劑量為參照，結合腸道微生物利用率，通過動物及人體喂養(yǎng)實驗，最終確定嬰兒配方食品中乳鐵蛋白的最佳添加劑量，使其真正起到提高嬰兒免疫力的作用，為嬰兒配方食品的生產及產品品質的提升提供科學的研究數據。

4 結 論

巴氏殺菌后牛源乳鐵蛋白均可通過增加基因cyclin B1、CDK1和cyclin E1的表達水平，降低p21的表達水平促進IEC-6細胞增殖，減緩細胞凋亡。巴氏滅菌雖可部分損傷乳鐵蛋白的免疫活性基團，但不能使其完全失活。選擇適宜的工藝參數如72 ℃、15 s和85 ℃、15 s可最大化地保留乳鐵蛋白的免疫活性。通過體外實驗得出乳鐵蛋白水解液促進嬰兒腸道免疫的最佳劑量為0.1 mg/mL。巴氏殺菌可以很好地保留生鮮乳中免疫蛋白的免疫活性，這為現階段乳制品加工工藝參數設計以及營養(yǎng)補充劑添加量提供理論依據，為國內本土生鮮乳加工利用提供新的方向。