陳立新 綜述 趙玉婉，柳建軍 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，廣東 湛江 524000

腎細胞癌(RCC)是一種常見的致死性惡性腫瘤，約占成人惡性腫瘤的5%，是全球十大最常見癌癥之一。20%～30%的腎細胞癌患者在被確診后仍有病情局部加重或腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，30%～50%的腎細胞癌患者在原發(fā)腫瘤切除后病情仍得不到控制[1]。目前，手術(shù)切除是腎細胞癌患者的主要治療方法，但由于腎細胞癌患者對化療和放療的抵抗，腎細胞癌很容易發(fā)展為惡性潛伏期。因此，進一步了解腎細胞癌的具體分子機制至關(guān)重要。

1 miRNA簡介

自1993 年首次在秀麗隱桿線蟲的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA 后，人們很快意識到其廣泛而重要的作用[2]。microrna(miRNA)是一組內(nèi)源性非編碼功能RNA，長度約為18～25個核苷酸，廣泛存在于動植物中，其生物合成和調(diào)控功能在維持細胞內(nèi)平衡中具有重要意義。miRNA 是由位于基因間區(qū)和內(nèi)含子基因區(qū)域的DNA區(qū)域轉(zhuǎn)錄而來，但也存在于外顯子基因區(qū)域和反義轉(zhuǎn)錄本中[3]。miRNA 從初始加工到最終成熟，均由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄，這些RNA聚合酶在5'端生成含有帽狀結(jié)構(gòu)的莖環(huán)初級miRNA(pri-miRNA)，并在3'端發(fā)生聚腺苷酸化[4-6]。然后，在細胞核中，通過Drosha/DGCR8 復(fù)合物將pri-miRNA 裂解為莖環(huán)前體miRNA(pre-miRNA)，之后，出口蛋白5(XPO5)通過核孔介導(dǎo)易位將pre-miRNA 轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，RNase ⅢDicer和TARbinding protein (TRBP)進一步處理該分子，轉(zhuǎn)化為包含miRNA-guide 鏈和miRNA-passenger 鏈的雙鏈成熟RNA。它們與Argonaute 一起被整合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)中，以沉默靶向mrna(mRNA)[3，7-8]。單個mRNA可能被多個不同的miRNA靶向，其效率各不相同，相反，一個miRNA可以靶向一個以上的mRNA。miRNA 通過與靶向mRNA 序列的結(jié)合，具有多種生物學(xué)功能，如抑制或促進許多相關(guān)基因表達的能力，而這些基因可以影響腫瘤發(fā)生發(fā)展所必需的細胞生物學(xué)功能，如細胞增殖、分化、遷移和凋亡[9-10]。

2 miRNA與腎細胞癌

微陣列表達數(shù)據(jù)證明了miRNA 表達異常在癌癥中非常常見[11-12]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，通過基因芯片、實時PCR 等高通量技術(shù)，在腫瘤組織和正常組織中可以快速建立miRNA表達譜，并證實在大多數(shù)腫瘤中miRNA表達失調(diào)[13-14]。此外，miRNA在臨床上可應(yīng)用于癌癥管理，不僅在腫瘤診斷，而且可評估惡性腫瘤治療效率，并監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)和進展情況。RCC占所有成人惡性腫瘤的2%～3%，占腎臟原發(fā)性惡性腫瘤的90%，是僅次于前列腺癌和膀胱癌的第三常見泌尿系腫瘤，死亡率極高[15]。腎細胞癌有多種組織學(xué)亞型，最常見的亞型包括透明細胞癌(ccRCC)、乳頭狀癌和嫌色性腎細胞癌。這些亞型加起來約占所有確診腎細胞癌的90%。腎切除術(shù)是目前腎細胞癌患者最佳的治療選擇，但20%～40%的患者術(shù)后會發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。由于轉(zhuǎn)移性腎癌的預(yù)后情況比較差，而且其對放療、化療均不敏感，臨床上尚無輔助治療，3 年平均存活率低于5%[16]。目前，RCC 的一些預(yù)后因素被應(yīng)用于臨床，包括腫瘤分期、Fuhrman 分級、淋巴結(jié)受累和組織學(xué)亞型。然而，這些因素在預(yù)測疾病方面缺乏準確性，尤其是在診斷非轉(zhuǎn)移性疾病患者中。RCC的預(yù)后結(jié)果相差很大，現(xiàn)今用于該病早期檢測和隨訪的現(xiàn)有生物標志很少，這導(dǎo)致其預(yù)后不良，因此尋找新的可靠的生物學(xué)標志物，對腎細胞癌的早期診斷、治療及預(yù)后有重大意義。

3 miRNA在腎細胞癌中的表達

大量的研究證明，miRNA 可通過調(diào)節(jié)細胞代謝、分裂、分化、發(fā)育和凋亡等關(guān)鍵過程，進而在腎細胞癌中扮演抑癌基因的角色和癌基因的角色。近年來，人們在發(fā)現(xiàn)新的miRNA、識別miRNA 靶點和破譯miRNA功能方面進行了大量的研究[17]。而計算方法的應(yīng)用有助于闡明miRNA的生物學(xué)作用，因為生物信息學(xué)可以通過建立一種假設(shè)來揭示統(tǒng)計上顯著的趨勢，然后通過實驗加以證實。例如，通過對miRNA數(shù)據(jù)集的綜合分析，識別與腫瘤發(fā)展相關(guān)的miRNA[14]，此外，通過整合轉(zhuǎn)錄組分析已證實腫瘤中miRNA-mRNA的相互作用[18]。而且，通過綜合生物信息學(xué)計算，可以探索miRNA表達與基因或通路之間的關(guān)系[19]。例如ZHOU等[20]從腫瘤基因組圖譜(TCGA)中共獲得525 個透明細胞RCC (ccRCC) miRNA 表達譜。將1.5 倍的差異定義為截止水平，在檢測到的1 046個人類miRNA中，有143 個miRNA 表達在RCC 和鄰近正常組織中存在顯著差異，其中62 個表達下調(diào)，81 個表達上調(diào)，其中miR-124和MEG3顯著下調(diào)。LIANG等[21]通過分析從TCGA 數(shù)據(jù)集中下載的miRNA 測序數(shù)據(jù)，在516 例CCRCC患者中發(fā)現(xiàn)63個差異表達的miRNA，其中34個表達上調(diào)，29個表達下調(diào)。HE等[22]利用微陣列基因芯片技術(shù)觀察到，在9 對ccRCC 樣品中，11 個miRNA在不同階段普遍失調(diào)，其中3 個上調(diào)(miR-491-3p、miR-487a和miR-487a)，而與正常組織相比，ccRCC樣本 中 的 miR-125b、miR-142-3p、miR-199a-5p、miR-532-5p、miR-299-3p、miR-29a、miR-429 和miR-22分別下調(diào)。SZABó等[23]發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，在24 個ccRCC 樣本中miR-21 和miR-221 均顯著升高，而且這些樣本中，上述miRNA 共同表達高達79.2%(19 例)，而在正常樣本中只有33.3%(8 例)共同表達。這提示miR-21 和miR-221 可能都參與了ccRCC的發(fā)生發(fā)展。

4 miRNA在腎細胞癌中的作用

越來越多的研究表明，miRNA在人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展中可能發(fā)揮了巨大的作用。許多miRNA 已經(jīng)在人類基因組中被發(fā)現(xiàn)，其中大多數(shù)在癌細胞和人類腫瘤中失去了調(diào)控[17，24]。miRNA生物通路的突變和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的解除以及表觀遺傳學(xué)的改變可能單獨或更有可能共同促進miRNA 在腫瘤發(fā)生中的作用[18-19]。最近的一項研究表明，miR-200b 是上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)的miRNA[25]。EMT 參與癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的初始步驟，其與上皮特征的缺失和間充質(zhì)標志物的獲得有關(guān)，而miR-200b 通過靶向表達ZEB1 和ZEB2 可以阻止這一過程。LI 等[26]發(fā)現(xiàn)與相鄰的正常組織相比，miR-200b 在臨床RCC 標本中的表達水平明顯較低，此外，miR-200b 的過表達不僅阻礙了Caki-1 和OSRC-2 細胞的增殖和遷移，還抑制了患者來源的異種移植物和細胞來源的異種移植物在裸鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。另一項研究表明，轉(zhuǎn)移瘤抗原-1(MTA-1)作為人類腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵介質(zhì)，通過抑制E-cadherin(上皮細胞鈣黏蛋白)轉(zhuǎn)錄，促進上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)過程[27]。YANG 等[28]則發(fā)現(xiàn)miR-30c 可降低Caki-1 細胞中MTA-1 的表達，進而抑制了細胞的增殖、侵襲、遷移。這提示miR-30c 可能參與下調(diào)MTA-1，抑制ccRCC 的發(fā)展。WANG 等[29]研究表明，在A498和786O細胞系中上調(diào)miR-30e-3p，通過直接靶向其3'-UTR，可以明顯降低Snail1的表達，顯著增強ccRCC細胞的侵襲和遷移。轉(zhuǎn)染缺乏3'-UTR的A498和786O 細胞，其增強了Snail1 的表達，與轉(zhuǎn)染空載體的細胞相比，miR-30e-3p抑制了ccRCC細胞的侵襲和遷移，這些結(jié)果表明，miR-30e-3p 通過直接抑制Snail1而增強了ccRCC細胞的侵襲和遷移能力。而有人利用TargetScan 工具，發(fā)現(xiàn)RAB23 是miR-384 的一個潛在靶基因，其是GTPases Rab 家族成員，是Sonic hedgehog基因信號通路的負調(diào)控因子，在癌癥的發(fā)展中起著重要的作用；與非腫瘤組織相比，RCC 組織中RAB23表達上調(diào)，35例患者中22例(22/35，62%)RCC組織中RAB23 表達較高，證明了在RCC 組織中miR-384的低表達與RAB23的高表達有關(guān)，即RAB23的過表達促進了RCC細胞的增殖、遷移[30]。HE等[31]則通過生物信息學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)HOXA3 mRNA 是miR-10b的一個潛在靶點，進一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達的miR-10b 抑制HOXA3 的表達，而miR-10b 的缺失顯著增強了HOXA3 的表達。此外，在ccRCC 細胞中敲低YAP 可明顯減少HOXA3 表達而敲低FAK 可同時降低YAP 和HOXA3 表達。顯然，這證明了miR-10b通過靶向ccRCC 中FAK/ YAP 信號通路調(diào)控的HOXA3 抑制細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。miR-218 在ccRCC組織中的表達水平低于相鄰非腫瘤組織，其低表達與更具侵襲性的腫瘤表型特征(包括更大的腫瘤和更高的腫瘤分期)顯著相關(guān)，而在功能檢測中，miR-218 過表達顯著抑制癌細胞增殖和遷移。

5 預(yù)后生物標志物

RCC患者的預(yù)后差異很大，早期發(fā)現(xiàn)有復(fù)發(fā)風險的患者可以改善患者預(yù)后。目前臨床上尚不能可靠地預(yù)測該疾病，因此確定新的生物標志物，可以幫助預(yù)測患者病情并改善預(yù)后。XIE等[32]從UCSC Xena下載臨床信息和癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫中ccRCC 的miRNA 表達譜，采用limma 包分析ccRCC 與正常組織中表達差異的miRNA，根據(jù)預(yù)后指數(shù)(PI)公式建立多變量Cox 回歸模型，按中位PI 將ccRCC 患者分為低危組和高危組。利用miRNet 進行靶基因預(yù)測和功能富集分析，確定了miRNA-21-5p、miRNA-9-5p、miR-149-5p 和miRNA 30b-5p 作為獨立的預(yù)后指標并使用這4 個miRNA 為每個患者構(gòu)建一個4-miRNA PI。發(fā)現(xiàn)高危組(n=119)患者的生存時間明顯短于低危組(n=118)(高危/低危組log-rank P=0.000)。與常規(guī)臨床病理特征相比，4-miRNA是一個獨立且全面的預(yù)后因素，其靶基因參與了與癌癥相關(guān)的各種通路，如MAPK、p53、Wnt 信號通路。因此4-miRNA 信號與ccRCC患者的生存相關(guān)，可以作為ccRCC預(yù)后的生物標志物[32]。CARLSSON等[33]利用RT-qPCR檢測116例ccRCC患者腎組織中miR-126、miR-21和miR-10b的表達。三種miRNA 在惡性組織和良性組織中均有差異表達，與良性組織相比，惡性組織中miR-126 (P=0.004)和miR-21(P＜0.001)上調(diào)，miR-10b(P＜0.001)下調(diào)。此外，miR-126 和miR-10b 在ccRCC 的分級和分期中也有差異表達。在單變量而非多變量模型中，miR-126的低表達與較短的復(fù)發(fā)時間有關(guān),在研究的3個miRNA中，miR-126的表達最有可能作為ccRCC患者的預(yù)后標志物。QUAN 等[34]發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p 在RCC 組織、RCC 細胞系中顯著上調(diào)，通過上調(diào)miR-23a-3p 可增強細胞活力，而沉默miR-23a-3p 可抑制ACHN和786-O細胞系的細胞活力、增殖和遷移；進行cox 比例危險回歸分析表明，低表達miR-23a-3p患者總體生存期顯著延長。此外，通過FFPE 腎細胞癌樣本分析miR-23a-3p 表達與患者總體生存率的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p表達水平與患者性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分期無顯著相關(guān)性，然而，miR-23a-3p過表達與晚期腫瘤有統(tǒng)計學(xué)上的顯著相關(guān)，即miR-23a-3p高表達的患者總體生存期顯著縮短，故miR-23a-3p可能是RCC診斷、疾病監(jiān)測和預(yù)后的一個可靠的生物標志物。LI 等[35]研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p 在786-0 和ACHN細胞周期的G2/M 期引起細胞周期阻滯。此外，在42份FFPE 腎細胞癌樣本中，miR-31-5p 表達水平與性別、年齡、腫瘤大小或腫瘤分期無關(guān)，但miR-31-5p低表達與總體生存期低明顯相關(guān)。Cox 比例危險回歸分析進一步說明，在單因素和多因素分析中，miR-31-5p 低表達的患者生存時間更短(P＜0.05)，這為miR-31-5p 作為ccRCC 患者的預(yù)后標志物提供了理論基礎(chǔ)。

6 治療

近年來，很多研究闡明了miRNA 在RCC 中的作用規(guī)律，其不僅是檢測預(yù)后的重要生物標志物，也是一種很有前景的治療方法，而且研究表明miRNA相關(guān)治療可能提高經(jīng)典化療的療效。例如，研究發(fā)現(xiàn)，與對舒尼替尼治療敏感者相比，對舒尼替尼治療抵抗的ccRCC 患者miR-141 明顯下調(diào)。舒尼替尼抗ccRCC的作用機制是通過抑制血管生成，誘導(dǎo)缺氧導(dǎo)致細胞凋亡，而在UMRC-2 和RCC4 細胞系的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-141過表達主要源于缺氧環(huán)境，增加了對舒尼替尼的敏感性[36-37]。另外，YANG等[38]研究發(fā)現(xiàn)，miR-30c感染Caki-1細胞后，紫杉醇和索拉非尼明顯抑制Caki-1細胞的存活和菌落形成能力。ZHONG等[1]利用生物信息學(xué)方法，證實HMGB1 為miR-505 的直接下游靶基因，且通過熒光素酶報告基因?qū)嶒炦M一步證實，并發(fā)現(xiàn)HMGB1 在腎癌組織中明顯過表達，與腎癌患者的臨床預(yù)后密切相關(guān)。此外，體外敲除RCC細胞系中的HMGB1 可抑制腫瘤生長，為以HMGB1 為靶點對RCC進行再灌注治療提供了新的理論依據(jù)[39]。

7 結(jié)語

miRNA 作為一種小分子的核苷酸非編碼RNA，是細胞增殖、分裂、分化和凋亡等過程的重要調(diào)控因子；它們參與了RCC 的多種生物學(xué)和病理過程。本文綜述了miRNA 的表達譜、生物學(xué)功能及其在RCC發(fā)生發(fā)展中的臨床意義。大量的研究結(jié)果表明，miRNA 作為預(yù)測生物標志物和包括RCC 在內(nèi)的不同腫瘤類型的新治療方法正在出現(xiàn)。深入研究miRNA 調(diào)控RCC 發(fā)生發(fā)展的具體作用機制，對RCC的早期診斷、預(yù)后檢測及治療有重大的意義。但盡管近年來進展顯著，對RCC 與miRNA 之間的關(guān)系仍不完全了解，miRNA 治療應(yīng)用仍存在一些問題，如靶向性差、安全性低等，因此，需要進一步研究及明確miRNA 在RCC 中的具體調(diào)控機制，為尋找新的miRNA 相關(guān)藥物和特異性更高的藥物提供堅實基礎(chǔ)。相信隨著科學(xué)技術(shù)及研究的發(fā)展，miRNA 在RCC 中的功能和具體作用機制會進一步明確，miRNA 在RCC 的早期診斷、預(yù)后檢測及治療等方面將發(fā)揮更大的作用。