陳文生 綜述 趙穎海 審校

廣東醫(yī)科大學(xué)病理系，廣東 湛江 524023

程序死亡分子蛋白1(programmed death-1)是由ISHIDA等[1]在1992年通過(guò)消減法技術(shù)中發(fā)現(xiàn)的。其廣泛存在于各類淋巴及巨噬細(xì)胞表面，而在活化的T淋巴細(xì)胞的表面因子也是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。在正常情況下，T細(xì)胞是人體內(nèi)重要的細(xì)胞免疫細(xì)胞，可以識(shí)別和殺傷細(xì)菌、病毒以及人體內(nèi)失去調(diào)控變異細(xì)胞等功能。而與其相對(duì)應(yīng)的程序性死亡蛋白配體1(programmed cell death 1 ligand 1，也稱 PD-L1)是由DONG等[2]從胎盤基因文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)。PD-L1屬于B7家族，主要存在于胎盤、肺、心、肝及免疫器官，其他正常組織經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)也能表達(dá)，其主要作用是調(diào)節(jié)人體免疫功能。當(dāng)PD-L1與T細(xì)胞中PD-1蛋白配對(duì)結(jié)合時(shí)，就會(huì)使得免疫細(xì)胞失去攻擊能力，以此保護(hù)正常組織。腫瘤細(xì)胞正充分利用其特性，通過(guò)誘導(dǎo)后其表面PD-L1表達(dá)功能上調(diào)從而直接或間接抑制機(jī)體內(nèi)的T細(xì)胞對(duì)自身免疫殺傷癌細(xì)胞功能，進(jìn)而成為導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸重要原因之一[3]。因此PD-1與PD-L1研究有望成為腫瘤免疫治療的重要手段?，F(xiàn)對(duì)PD-1/PD-L1的相關(guān)作用機(jī)制及目前腫瘤治療的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 PD-L1/PD-L2分子機(jī)制

PD-L1(B7-H1)和 PD-L2(B7-DC)均為 B7同系物，并由位于染色體9 p24.1上的CD274基因編碼，其已均被證實(shí)為受體PD-1的配體[2，4]。在機(jī)體中，其在不同組織中差異性表達(dá)，但主要在T和B淋巴細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)、單核細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)、骨髓(BM)產(chǎn)生的肥大細(xì)胞及各種免疫器官中表達(dá)[5-6]，此外部分細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后均可表達(dá)PD-L1，如IL-21可誘導(dǎo)CD19+B細(xì)胞表達(dá)PD-L1，γ鏈細(xì)胞因子可誘導(dǎo)T細(xì)胞表達(dá)PD-L1[2]，以及干擾素(IFN)-γ可誘導(dǎo)激活非淋巴細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)，如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞等[8]。相關(guān)研究表明PD-L1在細(xì)胞區(qū)室中也廣泛存在[9]，包括存在于細(xì)胞膜之中的PD-L1(mPD-L1)，還包括細(xì)胞質(zhì)中的PD-L1(cPD-L1)、核中的PD-L1(nPD-L1)、血清中的PD-L1(sPD-L1)和外泌體中的PD-L1[9-14]。而在PD-L1 mRNA的表達(dá)中，CD274基因產(chǎn)生了兩個(gè)可供選擇的轉(zhuǎn)錄本。通過(guò)對(duì)約800個(gè)堿基序列(bp)進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其分子量為33 kDa，編碼290個(gè)氨基酸。PD-L1是一種跨膜糖蛋白，由一個(gè)包含免疫球蛋白(Ig)樣結(jié)構(gòu)域的大胞外區(qū)域、一個(gè)疏水跨膜結(jié)構(gòu)域以及30個(gè)氨基酸的胞質(zhì)尾部組成，不包含典型的信號(hào)基序[15]。此外，PD-L1啟動(dòng)子具有約220 bp的CpG甲基化位點(diǎn)，研究表明其可控制表觀遺傳[16]。PD-L2是PD1的第二配體，其與PD-L1大約有22%氨基酸同源[17]。與PD-L1相比，PD-L2的表達(dá)非常局限于活化的樹(shù)突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、BM來(lái)源的肥大細(xì)胞和腹膜B1細(xì)胞[18]。LPS和BCR可誘導(dǎo)B細(xì)胞表達(dá)PD-L2，GM-CSF和IL-4可誘導(dǎo)dc表達(dá)PD-L2[17]。這兩種PD-1配體在惡性腫瘤上都有被發(fā)現(xiàn)，但與PD-L1相比，PD-L2的表達(dá)程度較低[19]。

2 PD-1/PD-L1介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

PD-1與PD-L1的相互作用在維持免疫系統(tǒng)與抗腫瘤免疫反應(yīng)之間的平衡發(fā)揮關(guān)鍵性作用。PD-1通過(guò)產(chǎn)生與T細(xì)胞的受體(TCR)和CD28共同相互抑制的微團(tuán)簇，然后通過(guò)利用其在細(xì)胞上的組織相容的特性與抗原PD-L1相識(shí)別后激活原始T細(xì)胞，激活相關(guān)信號(hào)最終抑制細(xì)胞中葡萄糖的消耗、細(xì)胞因子的大量產(chǎn)生、T淋巴細(xì)胞的增殖和存活，此外它進(jìn)一步阻止了包括與GATA-3、T-bet和Eomes在內(nèi)的effector功能相關(guān)的TF表達(dá)[20]。因此其通過(guò)抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，在炎癥及腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)中同樣具有抑制作用。在腫瘤的微環(huán)境之中，PD-1通過(guò)TCR下游的信號(hào)可以活化T細(xì)胞表面表達(dá)，它在與配體PD-L1結(jié)合后通過(guò)傳遞抑制信號(hào)以調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化，PD-1連接減弱了TCR介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)，并直接損害PI3 K-Akt和Ras/MEK/ERK途徑的活性[21]，因此，PD-1介導(dǎo)的抑制途徑與降低T細(xì)胞增殖、促進(jìn)T細(xì)胞凋亡、導(dǎo)致T細(xì)胞衰竭密切相關(guān)。此外，PD-1與配體PD-L1相互結(jié)合導(dǎo)致CD3、ZAP70和蛋白激酶C的磷酸化降低，抑制T細(xì)胞 ERK活化，抑制 B細(xì)胞Igβ、Syk、PLC-γ2和ERK的鈣動(dòng)員和磷酸化[22-23]。不同細(xì)胞類型的PD-1與PD-L1結(jié)合有不同的功能。在影響T細(xì)胞中，PD-1通過(guò)多種方式抑制其活性，例如通過(guò)影響細(xì)胞周期、增殖、存活和細(xì)胞因子產(chǎn)生的多種調(diào)節(jié)因子來(lái)抑制細(xì)胞周期的進(jìn)展。此外，PD-1還參與TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)其增殖。Ras-PD-1調(diào)節(jié)SWAT3并與TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)協(xié)同作用[24]。其次，PD-1改變了活化的T細(xì)胞的代謝過(guò)程，從而產(chǎn)生更多的氧化微環(huán)境。關(guān)于PD-1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑已得到很好的認(rèn)知，但其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在腫瘤免疫治療方面所面臨的問(wèn)題仍是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。

3 PD-1/PD-L1與腫瘤的免疫逃逸

腫瘤通過(guò)多種途徑抑制損害腫瘤特異性免疫細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他與免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞的功能，從而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸，這些途徑主要包括：促進(jìn)T細(xì)胞表面抑制受體表達(dá)和抑制T細(xì)胞刺激性受體如T細(xì)胞受體(TCR)/CD3和CD28，通過(guò)聚集免疫抑制白細(xì)胞，逃避免疫的監(jiān)控，從而為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造了一個(gè)可以阻止抗腫瘤免疫反應(yīng)的微環(huán)境，包括抗原提呈細(xì)胞的缺陷、抑制細(xì)胞負(fù)性免疫調(diào)節(jié)和有缺陷的抗腫瘤T細(xì)胞。PD-1作為一種免疫抑制分子的受體，可阻止人類T淋巴細(xì)胞的增殖和活化，在免疫逃逸中發(fā)揮重要作用。PD-1/PD-L1信號(hào)通路相互作用導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸是目前的研究熱點(diǎn)也是研究的難點(diǎn)，目前尚未完全闡釋清楚，但是目前研究結(jié)果表明可能與以下幾個(gè)方面密切相關(guān)，(1)PD-1/PD-L1相互作用激活一種亦可抑制TCR介導(dǎo)的T細(xì)胞活化和增殖的信號(hào)，也可抑制干擾素-γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素-2等細(xì)胞因子的分泌，從而促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞凋亡和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化[25]。(2)PD-L1促進(jìn)腫瘤基質(zhì)上皮細(xì)胞的間質(zhì)化：上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)是指上皮細(xì)胞在機(jī)體各種刺激下誘導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。在腫瘤的整個(gè)發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中均可由EMT，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡化性轉(zhuǎn)變。CAO等[26]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD-L1一方面可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞中Twist和Slug的表達(dá)上調(diào)，另一方便可抑制E-cadherin的表達(dá)，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞間質(zhì)化，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)免疫逃逸，促進(jìn)腫瘤進(jìn)一步惡化。(3)許多參與T細(xì)胞活化的途徑，包括主要組織相容性復(fù)合體(MHC)-TCR-ZAP70-RAS-GTPase(RAS)-ERK和CD80-CD28-PI3 K蛋白激酶B(AKT)途徑等均受PD-1/PD-L1相互作用的調(diào)節(jié)[27]。因此PD-1/PD-L1信號(hào)通路對(duì)腫瘤免疫逃逸起著重要地位，而且這也是近年來(lái)PD-L/PD-L1作為免疫治療重要的理論依據(jù)所在。

4 PD-1/PD-L1的表達(dá)調(diào)控

PD-L1的表達(dá)受多種腫瘤微環(huán)境的局部刺激信號(hào)和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的干擾素(IFN)-γ誘導(dǎo)，有相關(guān)研究表明，NF-κB途徑可以抑制和損害IFN-γ介導(dǎo)的PD-L1誘導(dǎo)表達(dá)[28]，研究人員發(fā)現(xiàn)使用NF-κB抑制劑同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)下降。此外，腫瘤細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中表達(dá)PD-L1控制的刺激信號(hào)。許多炎性細(xì)胞因子可誘導(dǎo)PD-L1的表達(dá)。尤其是DC中的IL-1β、IL-6、IL-27、IL-10等[29]。致癌轉(zhuǎn)錄因子MYC在許多癌細(xì)胞中高表達(dá)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)MYC可以與PD-L1的啟動(dòng)子相結(jié)合，可降低PD-L1的表達(dá)[30]。

腫瘤內(nèi)基因突變、擴(kuò)增與PD-L1的調(diào)控相關(guān)，由于PD-L1位于9 p24.1號(hào)染色體基因編碼上，因此9 p24.1區(qū)域的擴(kuò)增與多種癌癥中PD-L1水平的升高密切相關(guān)[2，4]。而最近研究發(fā)現(xiàn)在三陰性乳腺癌中PD-L1的DNA拷貝數(shù)改變(CNAs)頻率增高，其可直接導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)增加[31]。

PD-L1的表達(dá)受腫瘤內(nèi)的表觀遺傳改變而改變，如啟動(dòng)子DNA的甲基化、組蛋白修飾和microRNAs中在不改變遺傳信息的情況下調(diào)節(jié)對(duì)DNA成分的識(shí)別和結(jié)合因素與轉(zhuǎn)錄因子，從而調(diào)節(jié)PD-L1的表達(dá)。PD-L1啟動(dòng)子的高甲基化與PD-L1的低表達(dá)密切相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)CD274啟動(dòng)子的高度甲基化可導(dǎo)致PD-L1表達(dá)下調(diào)/缺失[32]。而在許多癌癥中均曾被報(bào)道過(guò)存在PD-L1啟動(dòng)子甲基化的現(xiàn)象，因此PD-L1啟動(dòng)子甲基化可能對(duì)腫瘤患者預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1免疫治療的療效具有重要的臨床意義。此外在組蛋白修飾相關(guān)修飾方面，包括磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化和ADP核糖化，也都可以調(diào)節(jié)PD-L1基因表達(dá)，非糖基化的PD-L1磷酸化后泛素-蛋白酶體系統(tǒng)可以降解。因此，針對(duì)PD-L1多泛素化可能是增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)治療的一種途徑，PD-L1可在表皮生長(zhǎng)因子上受到乙?；野彼崃姿峄蛦畏核鼗饔么碳?，糖基化可導(dǎo)致PD-L1在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)穩(wěn)定，包括腫瘤干細(xì)胞長(zhǎng)蛋白半衰期，與逃腫瘤避免疫監(jiān)視有關(guān)[17]。因此組蛋白修飾可能影響PD-L1介導(dǎo)的免疫抵抗，并可能成為增強(qiáng)的潛在靶點(diǎn)抗腫瘤免疫反應(yīng)。作用于PD-L1的miRNA是含有約20個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，最近研究表明miRNAs可以直接或間接調(diào)節(jié)PD-L1具有免疫調(diào)節(jié)潛能[33]。在某些情況下，靶向miRNA可使PD-L1表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致抑制腫瘤生長(zhǎng)、侵襲以及增強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)和降低化療耐藥性有關(guān)。但也有部分miRNA可使PD-L1表達(dá)上調(diào)，從而導(dǎo)致相反的作用。研究發(fā)現(xiàn)在不同的小鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了靶向PD-L1的3'非翻譯區(qū)的miRNAs如：miR-34、miR-200、miR-138和miR-570，導(dǎo)致 PD-L1表達(dá)下調(diào)[34]。但也有研究發(fā)現(xiàn)部分miRNA如：MiR-20、MiR-21和MiR-130b通過(guò)抑制抑癌基因(PTEN)的表達(dá)，間接導(dǎo)致PD-L1表達(dá)上調(diào)[35]。

PD-L1的表達(dá)受腫瘤內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。轉(zhuǎn)錄因子AP-1是由c-Jun、FOS、MAF或ATF組成的二聚體復(fù)合物。最近研究發(fā)現(xiàn)在霍奇金淋巴瘤中，PD-L1可通過(guò)AP-1與第一內(nèi)含子的增強(qiáng)區(qū)相結(jié)合而誘導(dǎo)表達(dá)[36]。轉(zhuǎn)錄因子STAT3也參與調(diào)節(jié)PD-L1表達(dá)。DURAND等[37]研究發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞淋巴瘤中，STAT3通過(guò)與PD-L1啟動(dòng)子結(jié)合可導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)上調(diào)，相反通過(guò)抑制STAT3可以導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)下調(diào)。HIF-1α是非常重要的致癌因子，NOMAN等[38]研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)與 PD-L1近端啟動(dòng)子的結(jié)合刺激PD-L1的轉(zhuǎn)錄，因此HIF-1α的過(guò)度表達(dá)導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)上調(diào)。此外，轉(zhuǎn)錄因子MYC在許多腫瘤細(xì)胞表達(dá)并參與腫瘤整個(gè)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。但是MYC對(duì)PD-L1的調(diào)控仍不明確。部分研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中的MYC與PD-L1啟動(dòng)子結(jié)合導(dǎo)致PD-L1的表達(dá)下調(diào)，從而增強(qiáng)腫瘤的免疫殺傷能力[39]，但仍有部分研究者發(fā)現(xiàn)MYC轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和維持中的致病作用直接促進(jìn)腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化[40]。

5 PD-1/PD-L1免疫治療及耐藥性研究進(jìn)展

正是由于PD-1/PD-L1具有上述特點(diǎn)，因此其為當(dāng)今世界開(kāi)啟了腫瘤免疫治療的新時(shí)代，也使得腫瘤免疫治療成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)，其目的就是消除腫瘤的免疫逃逸，增強(qiáng)腫瘤的免疫效應(yīng)從而達(dá)到高效、特異的治療癌癥。而經(jīng)過(guò)近年來(lái)許多專家和學(xué)者的努力，PD-1/PD-L1免疫治療在許多癌癥治療當(dāng)中如惡行黑色素瘤、淋巴瘤、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、膀胱癌、尿路上皮癌等均取得明顯療效。目前已被FDA批準(zhǔn)分為兩類，一類是阻斷PD-1/PD-L1軸PD-1抗體如單抗帕博利珠單抗(pembrolizumab)、納武利尤單抗(nivolumab)、cemiplimab，另一類是抗 PD-L1單抗atezolizumab、durvalumab和avelumab。雖然PD-1/PD-L1免疫治療因個(gè)體的異質(zhì)性，所以其療效有較大差距，但其對(duì)比未使用免疫治療劑的生存率有了明顯提升，因此PD-1/PD-L1的異質(zhì)性也是當(dāng)今的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。而在PD-1/PD-L1免疫治療的過(guò)程中，人們發(fā)現(xiàn)免疫治療的耐藥性也是當(dāng)今仍未解決難點(diǎn)，而關(guān)于其免疫治療耐藥機(jī)制尚未完全清楚，但目前研究發(fā)現(xiàn)與以下幾種機(jī)制有著密切關(guān)系，(1)腫瘤抗原表達(dá)缺失：腫瘤突變負(fù)擔(dān)(TMB)為每百萬(wàn)基因突變包括編碼錯(cuò)誤、中排、插入、缺失等的總數(shù)[41]，而每當(dāng)基因突變數(shù)增加時(shí)會(huì)產(chǎn)生更多新抗原，從而導(dǎo)致腫瘤被特異性T細(xì)胞攻擊，增加了對(duì)PD-L1治療的敏感性。因此高水平的TMB可導(dǎo)致PD-L1阻斷敏感、低水平的TMB導(dǎo)致較低的免疫原性使得治療效果差。(2)缺乏有效的抗原提呈細(xì)胞(APCs)：APCs是一類將抗原處理后并將其處理后層遞給T細(xì)胞，然后T細(xì)胞發(fā)揮免疫反應(yīng)，因此APCs在免疫治療環(huán)節(jié)中起著很重要作用。其中樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)是一類非常重要的人體抗原提呈細(xì)胞，人體DCs大多處于未成熟的狀態(tài)，未成熟的DCs細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗原性吞噬能力。在抗原刺激下，未成熟DCs可以分化為成熟DCs，成熟的DCs能夠表達(dá)高水平的共刺激和抑制因子，在成熟過(guò)程中，樹(shù)突狀細(xì)胞從外周組織遷移到次級(jí)淋巴器官，與T細(xì)胞接觸，刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)。DCs是目前發(fā)現(xiàn)的最有效APCs，能夠影響特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTLs)的產(chǎn)生。同時(shí)腫瘤微環(huán)境能影響DCs的分布、分化與成熟[42]。(3)腸道菌群可以影響腫瘤發(fā)展和PD-1/PD-L1免疫治療的效果：研究發(fā)現(xiàn)雙桿菌可以刺激DCs，誘導(dǎo)其成熟，促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活和PD-1/PD-L1阻斷的增加，從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[43]。(4)T細(xì)胞趨化因子：能夠?qū)⒚庖呒?xì)胞吸引到特定部位，一方面，腫瘤和腫瘤組織中 的 基 質(zhì) 細(xì) 胞 招 募 CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCL3、CCL4、CCL5等趨化因子來(lái)招募NK細(xì)胞和ctl引起腫瘤反應(yīng)；另一方面，腫瘤微環(huán)境中高水平的趨化因子如CCL2和 CCL22，通過(guò)招募 MDSCs、Tregs、m2等免疫相關(guān)抑制細(xì)胞來(lái)抑制免疫應(yīng)答[44]。(5)參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路：如PI3 K-AKT-mTOR參與細(xì)胞生存、增殖和分化等重要的細(xì)胞過(guò)程，MAPK途徑的激活許多不同的細(xì)胞過(guò)程，如增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、凋亡和存活，IFN-γ可上調(diào)MHC分子和PD-L1的表達(dá)，從而增強(qiáng)腫瘤抗原的遞呈和對(duì)PD-1治療的反應(yīng)等。正因?yàn)槟壳癙D-1/PD-L1免疫治療的局限性，因此結(jié)合其他療法如放療、化療等綜合性治療也成了當(dāng)今重點(diǎn)發(fā)展方向。

6 展望

雖然PD-1/PD-L1的表達(dá)在許多不同來(lái)源的腫瘤均已得到證實(shí)并且與腫瘤的免疫逃逸有著密不可分的關(guān)系，但其作為治療預(yù)后生物標(biāo)志物的價(jià)值和免疫治療利用的效率仍存在爭(zhēng)議。因此，為了更好的利用它們的特性，仍需要更加深入的去了解其分子機(jī)制、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、表達(dá)調(diào)控等各方面，才能更好突破PD-1/PD-L1在臨床免疫治療的局限性，為腫瘤診治開(kāi)辟新的方向。