檀暢，王喜良，張金艷，魏威，崔鑫，鄒朋書，于月新

（北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院生殖醫(yī)學中心，沈陽 110016）

隨著輔助生殖技術的快速發(fā)展，體外受精（IVF）技術為不孕不育夫婦提供了擁有自己后代的可能性，但IVF對于精子不能結合卵母細胞或精子不能穿透透明帶的情況卻無能為力，為解決此類難題，卵胞漿內單精子注射（ICSI）技術應運而生。此技術為許多男性少弱精子癥及無精子癥患者的生育提供了可能，但大量統(tǒng)計資料表明，采用ICSI的受精率也僅在70%左右，仍有30%的卵母細胞不受精，卵母細胞活化不足是ICSI受精失敗的重要因素之一［1］。其原因可能是雖然ICSI操作將精子直接注入卵母細胞，但其不能激活卵母細胞，無法完成后續(xù)的第二極體排出、DNA去緊密化、原核形成等過程，導致受精失敗。因此，ICSI應用于輔助生殖領域，雖然取得了不錯的臨床效果，但仍然不能完全避免受精失敗的發(fā)生，有研究認為ICSI操作中完全受精失敗的發(fā)生率約為2%～3%［2］。我中心也有類似ICSI后受精失敗的病例出現(xiàn)。分析其原因，發(fā)現(xiàn)ICSI操作受精失敗的卵母細胞中有80%以上處于MⅡ期阻滯狀態(tài)。隨著技術的不斷發(fā)展，有研究報道可以通過物理或化學的人工輔助激活方法使卵母細胞胞漿內產生鈣脈沖信號，誘導卵母細胞完成減數(shù)分裂從而改善ICSI受精失敗的結局，并獲得正常發(fā)育的胚胎［3］。國外已有利用人工輔助卵母細胞激活技術進行助孕治療并最終獲得健康且發(fā)育正常嬰兒的報道［4］。2015年，Karaca等［5］應用鈣離子載體成功激活卵母細胞并最終獲得健康胎兒。Eindhoven等［6］通過比較正常分娩嬰兒和通過輔助卵母細胞激活技術出生的嬰兒發(fā)現(xiàn)，二者的發(fā)育并未出現(xiàn)顯著差異。本研究回顧性分析我院收治的一對不育夫婦采用氯化鍶（SrCl2）輔助激活卵母細胞并行ICSI助孕成功妊娠的臨床資料，以期為臨床上卵母細胞激活的應用方案積累資料。

一、資料與方法

1．病例資料：不育夫婦中女方26歲，男方28歲，婚后未避孕但6年一直未孕。2016年因男方重度少弱精子癥，在外院行ICSI助孕，采用拮抗劑方案，予普利康150U啟動，Gn 11d，經陰道穿刺取卵（OPU）獲卵21枚，均未受精。染色體結果提示：46，XX，21ps＋。2017年來我中心就診，男方在我院精液常規(guī)檢查結果及服藥后復查結果均提示：嚴重少弱精子癥。

2．治療方案：夫妻雙方簽署知情同意書后行人工輔助激活卵母細胞ICSI助孕，并獲本院倫理委員會批準。采用本生殖中心常規(guī)的IVF－ET促排卵長方案［7］進行控制性促排卵，卵泡徑線達18mm時注射 HCG（艾澤，默克－雪蘭諾，德國）10 000U，36h后在陰道B超引導下穿刺取卵。女方于2018年8月30日取卵，獲卵19枚，其中15枚成熟卵。由于男方患有重度少弱精子癥，因此采用密度梯度離心法處理精液，將液化后的精液加入37℃恒溫的3ml梯度離心培養(yǎng)液中，600 g離心20min；吸出沉淀，加入3ml精子沖洗培養(yǎng)液后300 g離心5min待用。鏡下計數(shù)離心前后精子的濃度、活力。取卵后4h行ICSI。

ICSI操作前，取1mg SrCl2（Sigma，美國）置入1 338．56μl二甲基亞砜（DMSO）中溶解，分裝成每支10μl，－20℃冷凍儲存，此為100×濃縮液。用時取出1支，加至1ml培養(yǎng)液，終濃度為10mmol／L。ICSI后1h，將受精卵放入上述激活液內，培養(yǎng)箱（保溫、保濕、氣體平衡）中作用30min，培養(yǎng)液滴內洗滌5次以上，轉移至Quinns－1026卵裂液常規(guī)培養(yǎng)。

激活后16～18h進行原核評估，見到2個清晰獨立的原核為正常受精卵。其中4枚胚胎出現(xiàn)雙原核（即正常受精），培養(yǎng)至第3天（D3）得到4枚卵裂期胚胎，考慮到存在卵巢過度刺激綜合征（OHSS）風險，放棄鮮胚移植，挑選2枚發(fā)育良好的卵裂胚進行玻璃化冷凍；剩余2枚胚胎繼續(xù)培養(yǎng)至D7，僅形成1枚囊胚進行冷凍，另1枚胚胎退化。

二、結果

2019年1月3日復蘇該患者的2枚D3胚胎，復蘇存活率為100%。采用人工周期方案準備內膜，月經期開始使用補佳樂（戊酸雌二醇1mg／片，拜耳醫(yī)藥，德國）4mg，1周后B超監(jiān)測內膜厚度，達到8mm左右時給予黃體酮注射液（浙江仙琚制藥）60mg／d肌肉注射轉化內膜。之后將兩枚復蘇胚胎移植回體內。移植后14d妊娠試驗陽性，之后保持隨訪，B超檢查顯示單胎存活，常規(guī)產檢至8月27日順產分娩一男嬰，體重2 700g，孕周36＋3周，各項指標正常。

三、討論

精子和卵母細胞受精過程中啟動減數(shù)分裂恢復的關鍵因素是Ca2＋振蕩。在哺乳動物中，外源性的生理刺激可誘導其發(fā)生。卵母細胞激活的過程可通過人工誘導來實現(xiàn)，較常用的方法包括：電刺激的物理方法；在常規(guī)ICSI中將精子注入卵母細胞質膜時反復多次抽吸胞漿的機械刺激法；將卵母細胞暴露于Ca2＋載體 A23187、乙醇、伊屋諾霉素、SrCl2、巴豆醇、硫柳汞、蛋白質合成抑制劑或蛋白磷酸化抑制劑中等化學激活方法［8－12］。

現(xiàn)階段，人工卵母細胞輔助激活是治療既往ICSI受精低下或失敗的有效措施之一［13］。應用相對廣泛的主要有 Ca2＋載體［14］、6－二甲基氨基嘌呤（6－DMAP）［15］和等化學方法，其中SrCl2通過促進胞質內存儲的Ca2＋釋放來增加細胞內游離Ca2＋的濃度。Sr2＋與Ca2＋是同族的陽離子，其可經細胞膜上的Ca2＋通道進入細胞內，再通過磷酸肌醇途徑進入鈣池，置換出內質網和線粒體中的Ca2＋，使胞質內游離的Ca2＋增加。進入細胞內的Sr2＋不僅引起內源性Ca2＋的釋放并且不被消耗進而引起Ca2＋震蕩，不僅與正常受精非常相似，而且具有頻率低、幅度小、持續(xù)時間長等特點，能有效激活卵母細胞［17］。SrCl2在動物中的應用較為廣泛，目前其在人卵母細胞輔助激活中的應用在國內鮮有報道。國外有研究報道了5例Sr2＋輔助卵母細胞激活后分娩的嬰兒，觀察嬰兒出生后12個月內身體和智力的發(fā)育情況，結果未發(fā)現(xiàn)異常［18］。亦有文獻報道，6例患者使用10mmol／L SrCl2輔助激活卵母細胞后行鮮胚移植、凍融胚胎移植，最終4例患者成功妊娠，分娩健康嬰兒［19］。國外有學者跟蹤隨訪8名ICSI聯(lián)合SrCl2輔助激活分娩的嬰兒至60個月，發(fā)現(xiàn)8名嬰兒均發(fā)育正常、身心健康，與正常分娩的兒童無明顯差異［20］。上述研究在一定程度上證實了Sr2＋輔助激活卵母細胞方法的安全性。

不可否認，卵母細胞激活亟須深入研究，若能明確人工輔助激活卵母細胞安全有效的方法，不僅能解決大部分ICSI受精失敗的難題，并且對IVF受精失敗的卵母細胞也可以采用補救ICSI聯(lián)合人工輔助激活的處理方式，最大限度地挽救未受精卵母細胞，提高卵母細胞受精率，并在一定程度上改善胚胎的發(fā)育潛能，使更多患者獲得臨床妊娠及活產。本病例也是我中心胚胎實驗室首次應用SrCl2成功激活卵母細胞并聯(lián)合使用ICSI使患者獲得臨床妊娠。雖然眾多研究證據(jù)顯示SrCl2能有效激活卵母細胞，結合ICSI技術可以成功妊娠并獲得健康的新生兒，改善既往ICSI受精失敗或受精率低下患者的臨床結局。但是該方法中依然存在一些問題不容忽視，比如人工輔助激活的穩(wěn)定性，整個激活過程中任何細節(jié)的改變，都可能使胚胎面臨風險；SrCl2等不同的化學激活劑在激活過程中的最佳作用時間、激活方式等都需要大樣本的研究證實；目前所報道出生兒例數(shù)較少，其對子代的潛在影響尚難以確定。因此，對于既往ICSI受精失敗的患者，應持謹慎態(tài)度，在向患者夫婦介紹這種技術的同時也要向其詳細解釋該技術的風險以及對后代健康可能產生的影響，尊重患者的選擇。且本研究未設置對照組驗證卵母細胞激活的效果，后期需要增加數(shù)據(jù)收集并完善研究設計，進行深入的研究和探討，以早日明確其安全性，更好地應用于臨床。