閆吉昌，馬長海，于明明，辛若竹

（1.白城市產(chǎn)品質(zhì)量檢驗所，吉林白城 137000；2.梅河口市食品藥品檢驗檢測中心，吉林梅河口 135000）

甜蜜素雖然作為一種甜味劑廣泛應(yīng)用于各類食品中，但長期過量攝入也會損害健康，所以國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)[1]嚴(yán)格規(guī)定了其使用范圍和使用限量。酒類產(chǎn)品按生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品特性分為蒸餾酒、發(fā)酵酒和配制酒[2]。甜蜜素常作為甜味劑應(yīng)用于配制酒中，這是國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)允許的。而不法商販為改善酒品口感將甜蜜素應(yīng)用于蒸餾酒和發(fā)酵酒中，這卻是國家嚴(yán)格禁止的。所以為保證酒類產(chǎn)品的品質(zhì)，對酒中甜蜜素監(jiān)測是十分必要的。目前，甜蜜素測定的常用方法有氣相色譜法[3-4]、液相色譜法[5-6]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[7-9]。GB 5009.97—2016甜蜜素測定的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[10]中規(guī)定了不同種類產(chǎn)品與其相應(yīng)適用的分析方法，其中氣相色譜法不適用于酒類產(chǎn)品測定，液相色譜法適用于配制酒檢測，液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法適用于蒸餾酒和發(fā)酵酒測定。本文通過比較氣相色譜法、液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法3種國標(biāo)方法測定酒中甜蜜素含量，發(fā)現(xiàn)國標(biāo)氣相色譜法不能將酒中的干擾物分離，常出現(xiàn)甜蜜素假陽性結(jié)果，這與其規(guī)定的適用范圍相吻合；液相色譜法雖無基質(zhì)干擾現(xiàn)象，其檢出限滿足配制酒的檢測要求，但樣品衍生化時會產(chǎn)生有害物質(zhì)，對操作者有潛在的危害；液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法雖是檢測酒中甜蜜素最佳方法，但其設(shè)備比較昂貴，應(yīng)用范圍受限。為了找到實用性更好且對操作者無潛在危害的酒中甜蜜素的檢測方法，對國標(biāo)氣相色譜法進(jìn)行了改進(jìn)，通過優(yōu)化色譜條件，使改進(jìn)后的氣相色譜法能有效地消除基質(zhì)干擾，檢出限、回收率及精密度均能滿足配制酒日常檢測要求，且方法技術(shù)參數(shù)均優(yōu)于液相色譜法，擴展了國標(biāo)氣相色譜法的適用范圍。同時對國標(biāo)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的方法檢出限為0.01 mg/kg，低于國標(biāo)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法，能滿足酒中微量甜蜜素的檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：市售白酒。

試劑及耗材：甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.1 %，Dr.Ehrenstorfer）；色譜純甲醇、乙腈（Fisher Scientific）；色譜純正庚烷（CNW）；色譜純甲酸（CNW）；氫氧化鈉溶液（40 g/L）；硫酸溶液（200 g/L）；亞硝酸鈉溶液（50 g/L）；氯化鈉；硫酸溶液（1+1）；次氯酸鈉溶液（有效氯含量50 g/L以上）；碳酸氫鈉溶液（50 g/L）。

儀器及設(shè)備：GC2010plus氣相色譜儀（FID檢測器，日本島津公司）；HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；Agilent 1260高效液相色譜儀（DAD檢測器，美國安捷倫公司）；Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(2.7 μm,3.0×150 mm)；AB SCIEX API4000+超高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（ESI離子源，美國AB SCIEX公司）；Kinetex? 2.6 μm F5 100 ?色譜柱（50×3.0 mm）；渦旋混合器（美國talboys）；KH20R-Ⅱ高速冷凍離心機(湖南凱達(dá))；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 樣品處理

1.2.1 氣相色譜法和液相色譜法樣品溶液制備

稱取酒樣25.0 g于燒杯中，用氫氧化鈉溶液（40 g/L）調(diào)至pH7～8，60 ℃水浴加熱30 min以除去酒精，放冷，用水定容至50 mL備用。

1.2.2 氣相色譜法衍生化

準(zhǔn)確移取制備好的酒樣溶液10.0 mL于50 mL帶蓋離心管中，置冰浴中5 min后，準(zhǔn)確加入5.00 mL正庚烷，加50 g/L亞硝酸鈉溶液2.5 mL，加200 g/L硫酸溶液2.5 mL，蓋緊離心管蓋，搖勻，在冰浴中放置30 min，期間振搖3～5次；加入2.5 g氯化鈉，蓋上蓋后渦旋1 min，低溫3000 r/min離心10 min分層后，取上清液放置1～4 ℃冰箱冷藏保存以備進(jìn)樣。

1.2.3 液相色譜法衍生化

準(zhǔn)確移取制備好的酒樣溶液10.0 mL于50 mL帶蓋離心管中，加入2.0 mL硫酸溶液（1+1），5.0 mL正庚烷和1.0 mL次氯酸鈉溶液（有效氯含量50 g/L以上），劇烈振蕩1 min，靜置分層，除去水層后在正庚烷層中加入25 mL碳酸氫鈉溶液（50 g/L），振蕩1 min。靜置取上層有機相經(jīng)0.45 μm微孔有機相濾膜過濾，濾液進(jìn)樣備用。

1.2.4 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法樣品前處理

稱取酒樣1.0 g于50 mL燒杯中，加水1.0 mL，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘渣全部轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用水定容并搖勻，經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾后備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制（1.00 mg/mL）

精確稱取0.1124 g環(huán)己基氨基磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并定容至100 mL，混勻，此溶液1.00 mL相當(dāng)于環(huán)己基氨基磺酸1.00 mg。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列1

準(zhǔn)確吸取1.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL、1.00 mL、2.50 mL、5.00 mL、10.0 mL、25.0 mL于50 mL容量瓶，加水定容，混勻。配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液系列濃度分別為10 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液10.0 mL分別按1.2.2衍生化于氣相色譜分析，再分別按1.2.3衍生化于用于液相色譜分析。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列2

準(zhǔn)確吸取10 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL于10 mL容量瓶，加水定容，混勻。配成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列濃度分別為0.01 μg/mL、0.05 μg/mL、0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL。用于液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜分析。

1.4 色譜條件

1.4.1 氣相色譜條件

HP-5MS石英毛細(xì)管柱（30m×0.25mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度230 ℃，檢測器溫度260 ℃。柱流量1.00 mL/min，氫氣流速：40.0 mL/min，空氣流速：400.0 mL/min。分流進(jìn)樣，分流比1∶10，進(jìn)樣量1 μL。原國標(biāo)法柱溫升溫程序55 ℃保持3 min，10 ℃/min升至90 ℃保持0.5 min，20 ℃/min升至200 ℃保持3 min。優(yōu)化后的柱溫升溫程序55 ℃保持3 min，1 ℃/min升至60 ℃保持2 min，20 ℃/min升至200 ℃保持3 min。

1.4.2 液相色譜條件

Poroshell 120 EC-C18色譜柱2.7 μm，3.0×150 mm，流動相：乙腈+水（70+30），流速0.3 mL/min；檢測波長：314 nm；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.3 優(yōu)化的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜條件

1.4.3.1 色譜條件：Kinetex?2.6 μm F5 100 ?色譜柱50×3.0 mm，流動相：A泵為0.1%(v/v)甲酸水，B泵為甲醇，梯度洗脫程序B泵：0 min 3%；1 min，3 %；1.1 min，15 %；5.0 min，40 %；5.1 min，95 %；7.0 min，95 %；7.1 min，3 %；10 min，3 %。流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL。

1.4.3.2 質(zhì)譜條件

①負(fù)離子模式：

離子源：ESI；檢測方式：-MRM；離子源參數(shù)：電噴霧電壓（IS）：-4500 V；霧化氣壓力（GS1）：55 Psi；輔助氣壓力（GS2）：60 Psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 Psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃；噴撞氣（CAD）：7 mL/min。監(jiān)測離子對及電壓參數(shù)：定量離子對Q1/Q3：178.0/79.9 m/z；駐留時間:200 ms；去簇電壓（DP）：-60 V；碰撞氣能量（CE）：-35 V；碰撞池入口電壓（EP）：-10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：-15 V。

②正離子模式：

離子源：ESI；檢測方式：+MRM；離子源參數(shù)：電噴霧電壓（IS）：5500 V；霧化氣壓力（GS1）：55 Psi；輔助氣壓力（GS2）：60 Psi；氣簾氣壓力（CUR）：30 Psi；離子源溫度（TEM）：550 ℃；噴撞氣（CAD）：7 mL/min。監(jiān)測離子對及電壓參數(shù)：定性離子對Q1/Q3：202.2/122.1m/z；駐留時間：500 ms；去簇電壓（DP）：50 V；碰撞氣能量（CE）：11.8 V；碰撞池入口電壓（EP）：10 V；碰撞池出口電壓（CXP）：13 V。

1.5 樣品測定

1.5.1 氣相色譜法

分別吸取1 μL經(jīng)衍生化處理的標(biāo)準(zhǔn)系列各濃度溶液上清液，注入氣相色譜儀中，可測得不同濃度被測物的響應(yīng)值峰面積，以濃度為縱坐標(biāo)，以環(huán)己醇亞硝酸酯和環(huán)己醇兩峰面積之和為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同的條件下進(jìn)樣1 μL經(jīng)衍生化處理的試樣待測液上清液，保留時間定性，測得峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣液中的甜蜜素濃度。

1.5.2 液相色譜法

分別吸取5 μL經(jīng)衍生化處理的標(biāo)準(zhǔn)系列各濃度溶液上清液，注入液相色譜儀中，可測得不同濃度被測物的響應(yīng)值峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，以環(huán)己基氨基磺酸鈉衍生化產(chǎn)物N,N-二氯環(huán)己胺峰面為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在完全相同的條件下進(jìn)樣5 μL經(jīng)衍生化處理的試樣待測液上清液，保留時間定性，測得峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣液中的甜蜜素濃度。

1.5.3 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法

1.5.3.1 定量測定

將配制好的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列2按照濃度由低到高的順序進(jìn)樣測定，以環(huán)己基氨基磺酸鈉定量離子的色譜峰面積對相應(yīng)的濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。將試樣溶液注入液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀中，得到環(huán)己基氨基磺酸鈉定量離子峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算試樣溶液中環(huán)己基氨基磺酸鈉的濃度。

1.5.3.2 定性測定

在相同的試驗條件下測定試樣溶液，若試樣溶液質(zhì)量色譜圖中環(huán)己基氨基磺酸鈉的保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液一致（變化范圍在±2.5%以內(nèi)），且試樣定性離子的相對豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液中定性離子的相對豐度，其偏差不超過規(guī)定要求（相對豐度＞50 %，允許±20 %偏差；相對豐度＞20 %～50%，允許±25%偏差；相對豐度＞10%～20%，允許±30%偏差；相對豐度≤10%，允許±50%偏差），則可判定樣品中存在環(huán)己基氨基磺酸鈉。

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法優(yōu)化

2.1.1 前處理方法改進(jìn)

取酒樣1.0 g，加1 mL水，于60 ℃水浴上加熱30 min，殘渣全部轉(zhuǎn)移并定容至10 mL。這樣能將酒中的揮發(fā)成分徹底去除，降低本底干擾，提高甜蜜素質(zhì)譜響應(yīng)信號。

2.1.2 色譜條件優(yōu)化

由于甜蜜素的負(fù)離子對178.0/79.9 m/z的響應(yīng)信號特強，而正離子對202.2/122.1 m/z響應(yīng)信號相對較弱，針對此特征，本文采用0.1%(v/v)甲酸水-甲醇體系為流動相，提高甜蜜素的正離子對的響應(yīng)值，同時與國標(biāo)法相比，流動相未引入銨鹽，降低了質(zhì)譜系統(tǒng)損壞的風(fēng)險。

2.1.3 方法的校準(zhǔn)曲線和檢出限

按照本文液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法優(yōu)化的色譜條件，對甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列2進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，濃度在0.01～0.05 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，回歸方程y=4479180x+10749和相關(guān)系數(shù)R=0.9999；甜蜜素的負(fù)離子質(zhì)譜響應(yīng)信號遠(yuǎn)大于正離子響應(yīng)信號，以正離子模式信噪比為響應(yīng)，計算方法檢出限更具有實際意義。圖1為標(biāo)準(zhǔn)曲線第一個濃度點0.01 μg/mL測得正離子模式下信噪比圖，以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限為0.01 mg/kg，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限為0.03 mg/kg。說明該方法的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國標(biāo)方法的檢出限，能滿足酒中微量甜蜜素的檢測要求。

圖1 正離子模型下的信噪比圖

2.1.4 方法的精密度和加標(biāo)回收率

選取一市售白酒樣品，按3個濃度水平加入甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，制備成加標(biāo)樣品，分別對白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品進(jìn)行測定，對每個添加水平重復(fù)測定6次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，數(shù)據(jù)見表1。甜蜜素的MRM色譜圖見圖2。結(jié)果表明，酒樣中甜蜜素的加標(biāo)回收率在90%～108%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.69%～1.78%的范圍內(nèi)，說明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠。

2.2 液相色譜法分析結(jié)果

2.2.1 酒樣本底干擾試驗

將上述經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定無甜蜜素的白酒樣品，添加甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備成加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度100 mg/kg），按照液相色譜法分別對白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品及甜蜜素標(biāo)液（100 μg/mL）進(jìn)行測定，得到白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品及甜蜜素標(biāo)液的色譜圖。對比白酒樣品色譜圖（圖3a）和白酒加標(biāo)樣品色譜圖（圖3b）及甜蜜素標(biāo)液色譜圖（圖3c）可以看出，白酒樣品在甜蜜素出峰時間點上未出現(xiàn)色譜峰，白酒加標(biāo)樣品和甜蜜素標(biāo)液均在甜蜜素出峰時間點上出現(xiàn)了色譜峰，說明液相色譜法測定白酒中甜蜜素?zé)o本底干擾。

表1 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法回收率及精密度測定結(jié)果(n=6)

圖2 白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品、甜蜜素標(biāo)液的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖

2.2.2 液相色譜法技術(shù)參數(shù)考察

按照本文液相色譜法，對甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列1進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限。同時將2.2.1中測得的加標(biāo)樣品計算的回收率、精密度均列入表2中。由表2可知，液相色譜法的方法檢出限雖然不能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對白酒（蒸餾酒）的檢測要求，但完全滿足配制酒的檢測要求。然而液相色譜法存在不足之處，樣品衍生化時會產(chǎn)生有害物質(zhì)，對操作者有潛在的危害。

2.3 氣相色譜法分析結(jié)果

2.3.1 國標(biāo)氣相色譜法酒樣本底干擾試驗

表2 液相色譜法技術(shù)參數(shù)

將上述經(jīng)液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定無甜蜜素的白酒樣品，添加甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)溶液制備成加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度20 mg/kg），按照國標(biāo)氣相色譜法分別對白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品及甜蜜素標(biāo)液（100 μg/mL）進(jìn)行測定，得到白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品及甜蜜素標(biāo)液的色譜圖。對比白酒樣品色譜圖（圖4a）和白酒加標(biāo)樣品色譜圖（圖4b）及甜蜜素標(biāo)液色譜圖（圖4c）可以看出，白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品和甜蜜素標(biāo)液均在甜蜜素出峰時間點上出現(xiàn)了色譜峰，說明國標(biāo)氣相色譜法測定白酒中甜蜜素有本底干擾。

2.3.2 改進(jìn)氣相色譜法酒樣本底干擾試驗

按照改進(jìn)氣相色譜法分別對上述白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度20 mg/kg）及甜蜜素標(biāo)液（100 μg/mL）進(jìn)行測定，得到白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品及甜蜜素標(biāo)液的色譜圖。對比白酒樣品色譜圖（圖5a）和白酒加標(biāo)樣品色譜圖（圖5b）及甜蜜素標(biāo)液色譜圖（圖5c）可以看出，不含甜蜜素的白酒樣品在甜蜜素出峰時間點上未出色譜峰，白酒加標(biāo)樣品和甜蜜素標(biāo)液均在甜蜜素出峰時間點上出現(xiàn)了色譜峰，說明改進(jìn)氣相色譜法測定白酒中甜蜜素?zé)o本底干擾。

圖4 白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品、甜蜜素標(biāo)液國標(biāo)法氣相色譜圖比較

圖5 白酒樣品、白酒加標(biāo)樣品、甜蜜素標(biāo)液改進(jìn)法氣相色譜圖比較

2.3.3 改進(jìn)氣相色譜法技術(shù)參數(shù)考察

按照本文改進(jìn)氣相色譜法，對甜蜜素標(biāo)準(zhǔn)工作溶液系列1進(jìn)行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍信噪比（S/N=3）計算方法的檢出限，以10倍信噪比（S/N=10）計算方法的定量限。同時將2.3.2中測得的加標(biāo)樣品計算的回收率、精密度均列入表3中。由表3可知，改進(jìn)氣相色譜法的方法檢出限雖然不能滿足國家標(biāo)準(zhǔn)對白酒（蒸餾酒）的檢測要求，但完全滿足配制酒的檢測要求，而且方法技術(shù)參數(shù)均略優(yōu)于液相色譜法，且對操作者無潛危害，實用性更好。

3 結(jié)論

通過比較分析3種國標(biāo)方法測定白酒中甜蜜素含量，得出以下結(jié)論：優(yōu)化的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法檢出限更低，方法準(zhǔn)確、可靠，更適合于白酒（蒸餾酒）中微量甜蜜素的測定；液相色譜法檢出限滿足配制酒的檢測要求，但存在不足之處是樣品衍生化時會產(chǎn)生有害物質(zhì)，對操作者有潛在的危害；國標(biāo)氣相色譜法不能將酒中的干擾物分離，常出現(xiàn)甜蜜素假陽性結(jié)果，改進(jìn)的氣相色譜法能有效地消除基質(zhì)干擾，其檢出限、回收率及精密度均能滿足配制酒的檢測要求，而且方法技術(shù)參數(shù)均優(yōu)于液相色譜法，且對操作者無潛危害，實用性更好。

表3 改進(jìn)氣相色譜法技術(shù)參數(shù)