付常喜 李平 秦永生 彭朋

摘?要：目的：觀察高強度間歇訓練（HIT）對自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎臟纖維化的影響并探討炎癥反應和膠原代謝通路（合成代謝和分解代謝）在其間的作用機制，為制定針對高血壓腎病患者的最佳運動康復處方提供依據(jù)。方法：30只雄性SHR隨機分為安靜對照組（SHR-Sed）和HIT組（SHR-HIT），同時將15只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓組（WKY）。SHR-HIT組大鼠進行為期8周的間歇跑臺運動（5 d/week），WKY和SHR-Sed組保持安靜狀態(tài)。實驗后利用無創(chuàng)血壓測量儀測定尾動脈血壓;以24 h尿蛋白含量、血尿素氮（BUN）和血清肌酐（SCr）含量作為腎功能參數(shù);分離腎臟，利用HE和Masson染色進行組織病理學觀察，獲取間質膠原容積分數(shù)（CVF），Western blot法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）、環(huán)氧合酶2（COX-2）、轉化生長因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、結締組織生長因子（CTGF）、基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）、MMP-9以及組織金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表達量。結果：與WKY組比較，SHR-Sed組大鼠血壓、CVF以及24 h尿蛋白含量、BUN和SCr含量升高（P<0.05），腎臟TNF-α、IL-6、COX-2、TGF-β1、p-Smad2/3、CTGF和TIMP-1蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），MMP-2和MMP-9表達量以及MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值下降（P<0.05）;與SHR-Sed組比較，SHR-HIT組血壓和CVF下降（P<0.05），TNF-α、IL-6、COX-2、TGF-β1、p-Smad2/3、CTGF、TIMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量以及MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值均顯著性下降（P<0.05），24 h尿蛋白含量、BUN和SCr含量無顯著性變化（P>0.05）。結論：8周HIT能夠減輕炎癥反應并抑制膠原合成代謝進而改善SHR腎臟纖維化。然而由于膠原分解代謝通路同樣受到抑制且腎功能并未改變，長期HIT對高血壓腎病的健康效應尚待進一步證實。

關鍵詞：高強度間歇訓練;高血壓;腎臟纖維化;炎癥反應;細胞外基質

中圖分類號：G804.2?文獻標識碼：A?文章編號：1006-2076（2020）03-0075-08

Abstract：Objective：To evaluate the effects of high intensity interval training （HIT） on renal fibrosis and investigate the possible mechanism of inflammatory reaction and collagen metabolic pathway （anabolism and catabolism） in spontaneously hypertensive rats （SHR）， helping to provide evidence for optimal exercise rehabilitation prescription in patients of hypertensive nephropathy. Methods： 30 male SHR were randomly divided to sedentary （SHR-Sed） and HIT （SHR-HIT） groups， and 15 Wistar-Kyoto （WKY） were used as normotensive group. Animals in SHR-HIT group performed interval treadmill running training （5 d/week） for 8 weeks while those of WKY and SHR-Sed groups kept quietly. After test， parameters were measured including caudal artery blood pressure by non-invasive blood pressure tester， renal function by 24 h urine protein， blood urea nitrogen （BUN） and serum creatinine （SCr）， histopathological observation by HE and Masson's staining to obtain interstitial collagen volume fraction （CVF）， protein expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， phosphorylation of Smad2/3 （p-Smad2/3）， connective tissue growth factor （CTGF）， matrix metalloproteinase-2 （MMP-2）， MMP-9 and tissue inhibitors of metalloproteinase-1 （TIMP-1） by Western blot. Results： Compared with WKY group， blood pressure， CVF， 24 h urine protein， BUN and SCr increased （P<0.05）， protein level of TNF-α， IL-6， COX-2， TGF-β1， p-Smad2/3， CTGF and TIMP-1 upregulated （P<0.05） while MMP-2， MMP-9， MMP-2/TIMP-1 and MMP-9/TIMP-1 ratio downregulated（P<0.05） in SHR-Sed group; compared with SHR-Sed group， blood pressure （SBP） and CVF decreased （P<0.05）， protein level of TNF-α， IL-6， COX-2， TGF-β1， p-Smad2/3， CTGF， TIMP-1， MMP-2， MMP-9 and MMP-2/TIMP-1 as well as MMP-9/TIMP-1 ratio downregulated （P<0.05）， while 24 h urine protein， BUN and SCr showed no significant change in SHR-HIT group. Conclusion：HIT of 8 weeks improved renal fibrosis through alleviation of inflammatory reaction and suppression of collagen anabolism in SHR. However， health effect of long-term HIT on hypertensive nephropathy should be further confirmed due to inhibition of collagen catabolism pathway and no alteration of renal function.

Key words：high intensity interval training; hypertension; renal fibrosis; inflammatory reaction; extracellular matrix

高血壓患者持續(xù)血壓升高引起腎臟結構和功能損害（腎動脈硬化、腎小球濾過率增加、蛋白尿、腎臟炎癥、纖維化），最終導致腎功能衰竭，稱為高血壓腎病[1]。高血壓腎病的發(fā)生率與高血壓的嚴重程度和持續(xù)的時間呈正相關[1]。腎臟纖維化是腎臟重塑的主要外在表現(xiàn)，是高血壓患者最常見的并發(fā)癥之一，其嚴重程度與患者預后及死亡率密切相關[2]。腎臟纖維化的發(fā)生是由于細胞外基質（extracellular matrix，ECM）過度沉積造成的[3]。ECM的主要成分是膠原，由成纖維細胞產(chǎn)生，膠原合成與降解動態(tài)平衡對于維持腎臟正常結構與功能具有重要調(diào)節(jié)作用[4]。實驗證實，轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）-Smad[5]和基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）[6]分別是調(diào)控膠原合成與降解的主要信號途徑。TGF-β1是腎臟重塑和纖維化形成過程中的重要始動因子之一，具有刺激成纖維細胞合成膠原纖維的作用，其在高血壓大鼠腎小球和腎小管間質細胞中的表達量明顯上調(diào)[7]。TGF-β1能夠使胞漿中的Smad2和Smad3磷酸化，繼之轉移至細胞核通過上調(diào)多種促纖維化因子如結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）以及編碼ECM成分的基因表達，最終導致腎臟纖維化[8]。MMP是一類鋅依賴性蛋白水解酶家族，催化ECM蛋白降解，腎臟中主要表達MMP-2和MMP-9，其作用是降解變性膠原及其他ECM蛋白。MMP受TIMP負反饋調(diào)節(jié)，以防止ECM過度降解[6]。研究證實[5-6]，TGF-β-Smad信號活化（誘導膠原合成增加）和/或MMP/TIMP比值下降（造成膠原降解減少）是各種原因導致腎臟纖維化的主要分子生物學機制。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)[9]，炎癥反應是腎臟纖維化發(fā)生發(fā)展的進展的關鍵因素。針對慢性腎臟疾病動物模型和高血壓患者的臨床研究均觀察到腎臟中多種促炎細胞因子如白介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等含量顯著升高[10-12]。Jaimes等[13]的另一項研究表明，高鹽飲食誘導的高血壓大鼠腎皮質環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）基因表達量上調(diào)。由于COX-2是參與炎癥反應的關鍵酶，而非甾體抗炎藥（COX-2抑制劑）即通過抑制COX-2活性而發(fā)揮效應[14]，進一步證實炎癥反應介導了高血壓腎損傷的病理過程。高血壓腎病患者白細胞及其他細胞因子激活，從而出現(xiàn)慢性炎癥反應狀態(tài)，繼之加速慢性腎病和終末期腎病進程[9-10]。實驗證明[15]，炎癥因子如IL-6、TNF-α、COX-2可激活TGF-β-Smad信號通路，進而誘導腎臟纖維化。

運動療法是高血壓患者非藥物治療的主要手段，能夠降低血壓，減輕并發(fā)癥，下調(diào)多種心血管危險因素，改善生活質量并降低住院率與死亡率[16]。有氧運動是高血壓患者康復治療的主要運動方式，其對腎臟的作用包括增加腎血流量和氧供應、氧化應激、減輕腎臟炎癥反應、降低尿蛋白量等，因此同樣適用于高血壓腎病患者[17]。高強度間歇訓練（high intensity interval training，HIT）是近年來新興的一種運動模式，相對于傳統(tǒng)持續(xù)有氧運動具有省時有效、趣味性強、易于接受和堅持等突出優(yōu)勢[18-19]。然而對比多項研究后發(fā)現(xiàn)[20-24]，HIT對于心血管疾病的健康效應（尤其是心臟）尚存爭議。課題組前期的研究亦發(fā)現(xiàn)，有氧運動能夠抑制SHR心肌纖維化[21]，但長期高強度運動[22]或HIT[23]卻加重心臟重塑。然而HIT對腎臟纖維化的影響及機制尚不清楚。因此，本研究以SHR為研究對象，旨在觀察8周HIT對腎臟纖維化的影響并探討炎癥反應和膠原代謝通路（TGF-β-Smad和MMPs-TIMPs信號途徑）在其間的作用機制，為制定針對高血壓腎病患者的最佳運動康復處方提供依據(jù)。我們假設，HIT能夠改善SHR腎臟纖維化，其機制與減輕炎癥反應、抑制膠原合成代謝并促進膠原分解代謝有關。

1?研究對象與方法

1.1?實驗動物與分組

30只12周齡雄性SHR，體重（215±13）g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2018-0027。同時以15只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓組（WKY）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24℃～26℃，濕度50%～60%，12 h明暗周期，分籠（5只/籠）標準飼料飼養(yǎng)，自由進食水。動物適應環(huán)境1周后利用隨機數(shù)字表法將30只SHR隨機分為安靜對照組（SHR sedentary，SHR-Sed，n=15）和HIT組（SHR-HIT，n=15），其中SHR-HIT組進行為期8周HIT，WKY和SHR-Sed組保持安靜狀態(tài)（鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)）。

1.2?運動方案

大鼠先進行5 d跑臺適應性訓練，方案為：速度10～15 m/min，坡度0°，時間30 min/d。隨后參照課題組前期建立的方案[21， 23]測定大鼠運動能力：起始負荷5 m/min，坡度0°，每2 min增加1.5 m/min，直至力竭，記錄最大跑速（maximal velocity，Vmax）。隨后SHR-HIT組進行8周跑臺間歇訓練，訓練負荷（包括訓練強度、持續(xù)時間、完成組數(shù)以及每周頻率）逐級遞增（見表1）。分別于第2、4和6周重新測定Vmax并及時調(diào)整訓練強度（跑速）[23]。

1.3?尾動脈血壓測定

末次訓練后48 h，采用智能無創(chuàng)血壓測量儀（BP-2010E，日本）測定尾動脈血壓，包括收縮壓（systolic blood pressure，SBP）、舒張壓（DBP）和平均動脈壓（MAP）。測量前將尾部預熱15～20 min，待大鼠安靜后，重復測量3次，取平均值。

1.4?大鼠取材

所有大鼠過夜禁食，于干凈代謝籠內(nèi)留取24 h 尿液。大鼠稱量體重后用20%烏拉坦腹腔麻醉并固定，開胸后右心室采血3～5 mL。分離兩側腎臟，迅速在冷生理鹽水中洗滌，濾紙吸干水分后稱其質量并計算腎臟質量指數(shù)（腎臟質量÷體重）。一側腎臟用于病理組織學觀察，另一側用錫紙包裹迅速轉移至-80℃低溫冰箱凍存待測膠原含量以及蛋白表達量。

1.5?腎功能檢測

采用尿樣分析儀（AX-4280，日本）以雙縮脲法檢測尿液樣本24 h尿蛋白含量，生化分析儀（Bachman AU680，美國）檢測血液樣本尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）及肌酐（serum creatinine，SCr）含量。嚴格按照試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）說明進行操作，每個樣本重復3次取均值。

1.6?腎臟病理組織學觀察

將腎組織用中性甲醛溶液固定24 h，脫水后石蠟包埋，利用病理切片機（RM2255，德國）制作4 μm切片。分別行HE和Masson染色，倒置相差顯微鏡（歐林巴斯IX71，日本）下選取10個視野，對腎臟病理組織學進行觀察。用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，美國）測量Masson染色切片中結締組織面積與所測視野面積的比值作為間質膠原容積分數(shù)（collagen volumetric fraction，CVF）。

1.7?腎臟蛋白表達量檢測

利用Western Blot法檢測蛋白表達量。取適量腎臟組織勻漿后提取總蛋白，用考馬斯亮藍法測定總蛋白濃度。取100 μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)SDS-PAGE分離，隨后轉移至PVDF膜上。兔抗鼠一抗（包括TNF-α、IL-6、COX-2、TGF-β1、Smad2/3、CTGF、MMP-2、MMP-9和TIMP-1）4℃靜置孵育過夜，二抗（辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG）37℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL發(fā)光成像，掃描各條帶灰度值。將各組與β-actin的比值作為目的蛋白相對表達量，將各組蛋白相對表達量與WKY組的比值作為相對表達率。

1.8?統(tǒng)計學處理與分析

所有數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標準差”表示。各參數(shù)組間比較采用單因素方差分析，若F檢驗具有統(tǒng)計學意義，則多重比較采用LSD檢驗。顯著性水平定為α=005。統(tǒng)計軟件為SPSS 20.0 for Windows。

2?結果

2.1?樣本量分析

在實驗實施過程中，由于死亡、拒跑等原因，共剔除5只大鼠，因此最終樣本量n=40，其中WKY組（n=15）、SHR-Sed組（n=14）、SHR-HIT組（n=11）。

2.2?體重、腎臟指數(shù)、尾動脈血壓和腎功能的變化

與WKY組比較，SHR-Sed組SBP、DBP、MAP、24 h蛋白尿、BUN和SCr升高（P<0.05），與SHR-Sed組比較，SHR-HIT組SBP和MAP下降（P<0.05），腎功能無顯著性變化（P>0.05）。

2.3?腎臟病理組織學觀察及膠原含量的變化

腎臟HE染色見圖1所示，WYK組大鼠腎組織結構完整，無明顯病理改變;與WKY組相比，SHR-Sed組大鼠腎小管上皮細胞壞死，管腔擴張，間質增厚，伴有炎癥細胞浸潤;與SHR-Sed組相比，SHR-HIT組大鼠腎小管和腎小球病變減輕，炎癥細胞浸潤減少。

腎臟Masson染色見圖1所示，腎臟CVF的變化見圖2。WYK組腎臟間質有極少量膠原纖維，SHR-Sed組腎臟間質可見明顯纖維化改變及膠原沉積，CVF I含量較WYK組顯著性升高（P<0.05）;與SHR-Sed組比較，SHR-HIT組纖維化程度減輕、CVF下降（P<0.05）。

2.4?腎臟炎癥因子的變化

與WKY組比較，SHR-Sed組TNF-α、IL-6和COX-2蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），與SHR-Sed組比較，SHR-HIT組上述炎癥因子均下調(diào)（P<0.05）。見圖4～圖6。

2.5?腎臟膠原合成代謝信號通路各蛋白表達量的變化

與WKY組比較，SHR-Sed組TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），與SHR-Sed組比較，SHR-HIT組上述蛋白表達量均下調(diào)（P<0.05）。見圖7～圖9。

2.6?腎臟膠原分解代謝信號通路各蛋白表達量的變化

與WKY組比較，SHR-Sed組TIMP-1蛋白表達量上調(diào)（P<0.05），MMP-2和MMP-9表達量以及MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值下降（P<005）;與SHR-Sed組比較，SHR-HIT組TIMP-1、MMP-2和MMP-9蛋白表達量以及MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值均下降（P<0.05）。見圖10～圖13。

3?討論

本研究以SHR為研究對象，旨在觀察8周HIT對高血壓腎病腎臟纖維化的影響及可能機制，結果發(fā)現(xiàn)，SHR-Sed組腎臟炎癥反應增強，膠原合成代謝通路增強、分解代謝途徑受抑，膠原含量明顯增加并出現(xiàn)腎臟纖維化;經(jīng)過8周HIT后，SHR-HIT組腎臟炎癥反應減輕，膠原合成與分解代謝同時受到抑制，膠原含量減少、纖維化改善，但腎功能并無顯著性變化。因此，本研究結果部分證實了前述假設。由于8周HIT同時抑制膠原合成與分解代謝且腎功能并無改善，故長期HIT對高血壓腎病的健康效應尚待進一步證實。

臨床研究發(fā)現(xiàn)[1]，高血壓腎病患者腎臟病理生理學改變主要表現(xiàn)為腎炎、腎小球硬化、腎小管萎縮和腎臟纖維化。大量的成纖維細胞活化以及ECM過量產(chǎn)生和沉積，導致腎實質破壞、腎臟纖維化，最終引起腎功能進行性下降[1]。在本研究中，SHR-Sed組血壓、腎臟CVF以及24 h尿蛋白含量、BUN和SCr含量均顯著性升高，證實SHR合并腎病，腎間質膠原堆積并發(fā)生纖維化。有氧運動對多種原因引起的組織（心臟、肝臟、腎臟等）纖維化均具有改善效應[25]。已證實，規(guī)律有氧運動（跑臺、游泳等）[26-30]以及抗阻訓練[31-32]能夠抑制慢性腎病大鼠腎臟纖維化，然而HIT方式的作用鮮有關注。在本研究中，SHR-HIT組血壓和腎臟CVF下降，提示不同運動方式均可改善腎臟纖維化，其機制未明。

慢性炎癥反應伴隨高血壓腎病發(fā)生發(fā)展的整個過程[9]。動物實驗與人體研究均證實[9-12， 15]，炎癥因子表達上調(diào)是高血壓腎病的關鍵發(fā)病機制。抑制炎癥因子表達可減輕各種模型（如輸尿管阻塞、缺血-再灌注等）引起的腎臟損傷及纖維化[32-33]。在本研究中，SHR-Sed組TNF-α、IL-6和COX-2表達量較WKY組上調(diào)，而經(jīng)過8周HIT后，SHR-HIT組上述因子表達量均顯著性下降，與Huang等[28]以跑臺持續(xù)有氧運動以及Moraes等[31]和Souza等[32]以抗阻訓練為干預手段的研究結果一致，提示不同運動方式均能夠減輕高血壓引起的腎臟炎癥反應。炎癥因子不僅造成腎功能紊亂，而且是誘導肌肉萎縮（肌力下降）的重要介質[34]，因此HIT誘導炎癥因子下降將有利于提高高血壓腎病患者運動能力并減輕疲勞、呼吸困難等癥狀，進而改善生活質量。此外，Souza等[32]證實，運動還能夠上調(diào)慢性腎病大鼠腎臟抗炎因子（IL-4和IL-10）表達量，維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)，進而改善慢性炎癥反應狀態(tài)。

腎臟纖維化是腎臟膠原過度沉積造成的，由于膠原含量是其分解代謝與合成代謝相互作用的結果，因此膠原代謝穩(wěn)態(tài)平衡是腎臟纖維化的決定因素[35]。在本研究中，SHR-Sed組TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表達上調(diào)，提示介導膠原合成的TGF-β-Smad信號活化，炎癥因子上調(diào)是這一途徑激活的始動因素;另外，由于TIMP-1上調(diào)，MMP-2和MMP-9下降，說明介導膠原降解的MMP-TIMP途徑受到抑制。因此SHR腎臟纖維化是膠原合成增加以及降解減少造成的。經(jīng)過8周訓練后，SHR-HIT組TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF下降，提示膠原合成受抑。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，SHR-HIT組TIMP-1蛋白表達量較WYK組下降，似乎暗示TIMP-1對MMP-2和MMP-9的抑制效應減弱。然而Yang等[36]的研究進一步顯示，MMP與TIMP之間的動態(tài)平衡（用兩者的比值表示）才是膠原分解代謝的決定因素。SHR-HIT組MMP-2/TIMP-1和MMP-9/TIMP-1比值均下降，說明TIMP-1對MMP-2和MMP-9的抑制作用增強，MMP-TIMP信號系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)平衡進一步破壞，膠原降解減少，這一結果出乎意料，也就是說，HIT誘導腎臟的膠原來源（合成）減少與去路（分解）減少同時存在。由于SHR-HIT組腎臟纖維化改善，故推測HIT對膠原合成代謝抑制的程度必然高于分解代謝，提示腎臟宏觀表型與微觀分子變化之間并不一致，然而這一調(diào)節(jié)機制對于改善腎臟纖維化而言是一種不經(jīng)濟的方式，或者是一種潛在的病理狀態(tài)，腎功能無顯著性變化也間接證實了這一點，說明HIT對腎臟結構的良性作用并未轉化為腎功能的改善。發(fā)生這一改變的機制可能與HIT運動強度較高有關[37]。在Aparicio等[37]的研究中，健康SD大鼠進行為期12周高強度抗阻訓練后腎臟形態(tài)和功能均發(fā)生異常;Bongers等[38]證實，持續(xù)高強度甚至力竭運動可通過缺血-再灌注機制造成腎臟損傷。結合本研究結果我們認為，HIT對機體既具有良性效應又存在不利影響，鑒于此，長期HIT可能存在潛在風險。

課題組前期的研究證實，短期（8周）HIT改善SHR心肌肥大和心肌纖維化[21]，然而將干預時間延長至18周后（相當于人類運動10年）卻發(fā)現(xiàn)心臟重塑加重、心力衰竭進展加速[23]，提示HIT的心臟效應存在“一過性（暫時性）”特征。值得注意的是，Benito等[39]發(fā)現(xiàn)，SD大鼠18周高強度訓練誘導心肌纖維化，42%的動物發(fā)生心律失常，然而上述改變在停訓8周得到逆轉，提示高強度運動誘導的心肌纖維化具有可逆性特征。然而長期HIT對高血壓腎病的健康效應尚不得而知。結合本研究的結果，我們推測，長期（>8周）HIT可能誘導膠原合成增加和/或進一步抑制膠原分解，進而導致腎臟纖維化加重，若及時停訓或將降低運動強度，其纖維化程度將得以緩解，但這一推論尚需實驗證實。

4?結論

8周HIT通過減輕炎癥反應并抑制膠原合成代謝進而改善SHR腎臟纖維化。然而由于膠原分解代謝通路同樣受到抑制且腎功能并無改變，長期HIT對高血壓腎病的健康效應尚待進一步證實。

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