應(yīng) 翔，馮杏君，鄭靈芝

(浙江省臺州醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 臺州 317000)

卵巢癌起病隱匿，病程進展較快，對女性健康造成嚴重的威脅。卵巢癌的病死率位居婦科惡性腫瘤的首位[1]。大部分卵巢癌患者確診時已處于病程中晚期，且常伴有轉(zhuǎn)移[1]；在有效手術(shù)和以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療下，腫瘤細胞較易發(fā)生化療耐藥，導(dǎo)致復(fù)發(fā)率較高。因此，深入探索腫瘤進展和轉(zhuǎn)移機制，對于卵巢癌的早期診斷、開展新治療策略以及提高遠期生存率具有重要意義。

外泌體是直徑為30～100 nm的超微膜性囊泡，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，近年來成為學者關(guān)注的熱點。研究表明，腫瘤細胞、免疫細胞、紅細胞、血小板等幾乎所有類型的細胞都可釋放外泌體，外泌體內(nèi)攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂類等多種生物活性分子，在細胞間通信作用中發(fā)揮重要作用[2]。在腫瘤微環(huán)境中，外泌體通過調(diào)控腫瘤細胞生物學行為、血管生成、免疫耐受、腫瘤耐藥、轉(zhuǎn)移前環(huán)境形成等促進腫瘤進展及轉(zhuǎn)移[3-4]。此外，外泌體還可存在于血漿、唾液、尿液、乳汁、腦脊液、腹水等體液，正常人群和卵巢癌患者的外泌體數(shù)量及內(nèi)容物組成和含量均存在差異，可能成為疾病早期診斷的新的生物標志物[5]?，F(xiàn)就外泌體及其在卵巢癌早期診斷方面的研究進展予以綜述。

1 外泌體概述

1.1外泌體結(jié)構(gòu) 外泌體是細胞膜內(nèi)陷形成的微小囊泡，于1981年在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被首次發(fā)現(xiàn)，其形成過程主要包括細胞膜周圍早期核內(nèi)體的形成以及細胞核周圍晚期核內(nèi)體的發(fā)育成熟[6]。含有腔內(nèi)囊泡的成熟晚期核內(nèi)體，稱多泡體。多泡體可與溶酶體融合，通過水解降解其內(nèi)容物，還可與細胞膜融合，將其腔內(nèi)囊泡釋放到細胞外環(huán)境，即外泌體。免疫細胞、腫瘤細胞等多種細胞在正常和病理條件下均可分泌外泌體[3]。與正常細胞相比，腫瘤細胞在高壓、低氧的腫瘤微環(huán)境中可產(chǎn)生更多數(shù)量的外泌體[7]。

根據(jù)母細胞的類型和所處的微環(huán)境，外泌體內(nèi)富含不同類型的蛋白質(zhì)、核酸和脂質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，外泌體內(nèi)含有參與抗原遞呈的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ和主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ以及跨膜蛋白、膜聯(lián)蛋白等多種生物活性蛋白。此外，外泌體中包含DNA、非編碼RNA等核酸，通過調(diào)節(jié)基因表達和蛋白質(zhì)翻譯，在腫瘤發(fā)生發(fā)展以及疾病診斷中起重要作用[8]。外泌體的釋放依賴于H+/Na+和Na+/Ca2+等離子通道的參與，具有時間依賴性，并受到細胞外外泌體的反饋調(diào)節(jié)。

外泌體與靶細胞作用方式主要有：①與靶細胞直接融合，釋放內(nèi)容物至靶細胞中；②被靶細胞內(nèi)化，其內(nèi)容物被靶細胞攝?。虎叟c靶細胞表面特異性蛋白結(jié)合[9]。腫瘤細胞通過釋放富含蛋白、核酸等生物學活性的外泌體促進腫瘤轉(zhuǎn)移、形成適合腫瘤轉(zhuǎn)移部位的微環(huán)境、幫助腫瘤逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)視等。

1.2外泌體的分離與鑒定 血清和體液中外泌體數(shù)量和內(nèi)容物反映了釋放外泌體母細胞的生物學特性及刺激母細胞釋放的激活劑，故可通過對外周血或體液外泌體的分離及分析來評估和監(jiān)測腫瘤患者病情。目前，常用的外泌體分離方法是將不含外泌體的胎牛血清培養(yǎng)細胞的上清進行差異超速離心，轉(zhuǎn)速尚無統(tǒng)一標準，大部分研究采用(100 000～180 000)×g，離心30～60 min；隨后，根據(jù)細胞外液中外泌體處于低密度的特性將其與蛋白復(fù)合體等無膜囊泡分離。目前對外泌體的鑒定主要通過形態(tài)學觀察和蛋白分析的方法，透射電子顯微鏡可觀察外泌體的形態(tài)和大小。有學者報道了一個分析透射電子顯微鏡圖像中外泌體形態(tài)特征的新軟件[10]。流式細胞術(shù)是目前外泌體研究最常用的方法，可同時檢測外泌體表面的多種抗原，并進行定量。此外，納米顆粒追蹤分析可測量卵巢癌細胞外泌體的大小及其表面蛋白的表達[11]，但適當?shù)耐饷隗w分離檢測手段尚有待進一步探索。

2 外泌體與卵巢癌

2.1外泌體通過不同機制促進卵巢癌發(fā)生進展 腫瘤微環(huán)境由腫瘤細胞、基質(zhì)細胞及細胞外基質(zhì)構(gòu)成，在腫瘤進展轉(zhuǎn)移中起重要作用。外泌體通過傳遞內(nèi)容物至鄰近細胞發(fā)揮生理功能，從而建立適宜腫瘤生長轉(zhuǎn)移的局部微環(huán)境[12]。

外泌體通過調(diào)節(jié)腫瘤細胞生物學行為促進卵巢癌進展。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者尿液外泌體高表達微RNA(microRNA，miRNA/miR)-30a-5p，敲除miR-30a-5p基因可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖遷移能力。Enriquez等[14]研究認為，卵巢癌細胞外泌體高表達RNA結(jié)合蛋白——重組人RNA結(jié)合蛋白28，促進上皮間質(zhì)化轉(zhuǎn)變等過程。Kobayashi等[15]研究報道，卵巢癌細胞的侵襲能力與外泌體中l(wèi)et-7 和miR-200家族的富集密切相關(guān)?？梢?，外泌體可調(diào)節(jié)腫瘤細胞生物學行為，促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化指上皮細胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細胞的生物學過程。腹膜轉(zhuǎn)移是卵巢癌最主要的轉(zhuǎn)移方式。卵巢癌細胞間失去細胞間接觸，引起上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的癌細胞獲得較強的遷徙侵襲能力，進而原發(fā)灶癌細胞脫落穿透腹膜引起癌細胞的腹腔內(nèi)播散。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境中的腫瘤細胞及基質(zhì)細胞可通過傳遞外泌體內(nèi)容物誘導(dǎo)腫瘤細胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，在腫瘤的腹膜轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[16]。

新生血管的形成在腫瘤進展及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。Yi等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與低級別卵巢癌相比，高級別卵巢癌來源外泌體中富含活化轉(zhuǎn)錄因子2和腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1等，促進血管生成和腫瘤進展。有文獻報道，表達CD147(EMMPRIN)的卵巢癌細胞囊泡活化內(nèi)皮細胞(HUVEC)，促進新生血管的生成[18]。卵巢癌外泌體內(nèi)富含的可溶性上皮鈣黏素，促進新生血管形成，與卵巢癌患者惡性腹水形成及腹膜種植轉(zhuǎn)移相關(guān)[19]。由此可見，腫瘤來源的外泌體在新生血管形成中發(fā)揮重要作用。

腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移與腫瘤細胞所處的局部環(huán)境密切相關(guān)。外泌體介導(dǎo)的腫瘤細胞及其微環(huán)境間的相互作用對腫瘤進展十分重要。侵襲性卵巢癌細胞系及卵巢癌患者體液分離的外泌體攜帶膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1參與細胞外基質(zhì)降解，促進腫瘤進展[20]。Nakamura等[21]報道，卵巢癌細胞通過外泌體傳遞分化抗原44 (CD44)至間皮細胞，引起基質(zhì)金屬蛋白酶9分泌增加，形成促進卵巢癌進展的轉(zhuǎn)移龕，從而建立了外泌體促使適合卵巢癌進展轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境。

腫瘤細胞釋放的外泌體可抑制患者免疫系統(tǒng)，并協(xié)助形成腫瘤轉(zhuǎn)移前小灶。卵巢癌細胞通過外泌體誘導(dǎo)單核巨噬細胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細胞，抑制其吞噬功能，進而促進腫瘤轉(zhuǎn)移。M2型巨噬細胞由轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素-4等誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有抑制免疫應(yīng)答、促進腫瘤生長轉(zhuǎn)移的生物學作用。腫瘤相關(guān)巨噬細胞大多表現(xiàn)為M2型。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞外泌體來源的miR-222-3p可誘導(dǎo)巨噬細胞分化極化為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細胞，促進腫瘤進展[4]。卵巢癌外泌體可降低自然殺傷細胞對腫瘤細胞的殺傷毒性[22]?？梢姡[瘤來源的外泌體可通過調(diào)節(jié)微環(huán)境中的免疫細胞減弱免疫應(yīng)答，從而協(xié)助卵巢癌細胞逃避免疫攻擊。

2.2外泌體在卵巢癌早期診斷及治療監(jiān)測中的價值 卵巢癌往往起病隱匿，且預(yù)后較差，早期篩查診斷和治療是降低腫瘤死亡率的有效途徑。血清糖類抗原125和人附睪上皮分泌蛋白4的表達水平是目前最常用的卵巢癌早期診斷指標之一，但兩者在卵巢癌篩查中的敏感性和特異性均欠佳，需進一步尋找新的敏感性和可靠性較高的早期診斷標志物。外泌體在卵巢癌患者血清和腹水中廣泛存在，其在疾病診斷中的應(yīng)用逐漸受到關(guān)注。miRNA指約由22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，其表達水平失衡可能導(dǎo)致疾病發(fā)生。腫瘤細胞可釋放外泌體進入外周血，包裹在外泌體中的miRNA受到囊泡的保護，故其穩(wěn)定性較高。Ying等[4]研究發(fā)現(xiàn)，與健康女性相比，卵巢癌患者血清外泌體miR-222-3p表達水平較高。一項隊列研究表明，與早期卵巢癌(國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期Ⅰ～Ⅱ期)相比，中晚期卵巢癌(國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟分期Ⅲ～Ⅳ期)患者外周血外泌體miR-200b和miR-200c表達水平較高[23]。隨著卵巢癌病程的進展，很多患者表現(xiàn)為惡性腹水，血清外泌體中的miRNA譜作為一種無創(chuàng)檢查，可能成為卵巢癌早期篩查與診斷的新的生物標志物。

卵巢癌細胞外泌體內(nèi)富含生物活性蛋白分子。與正常對照組相比，卵巢癌患者外泌體高表達上皮細胞黏附分子[24]。黏附分子24(CD24)與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，卵巢癌患者腹水外泌體高表達CD24[25]。與早期卵巢癌患者相比，進展期卵巢癌患者腹水中外泌體數(shù)量更多，且外泌體中基質(zhì)金屬蛋白酶2表達水平升高[26]?？梢?，外泌體內(nèi)蛋白表達水平可能成為新的診斷卵巢癌的標志。此外，探索特異度和靈敏度較高的外泌體檢測方法對外泌體的臨床應(yīng)用非常重要。

除作為腫瘤早期檢查指標外，外泌體還可通過參與腫瘤細胞藥物代謝過程影響腫瘤細胞的耐藥性。有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體可提高上皮性卵巢癌對順鉑類藥物的耐藥性[27]。鉑類耐藥的卵巢癌細胞外泌體可提高非鉑類耐藥卵巢癌細胞的耐藥性。卵巢癌細胞中，對紫杉醇耐藥的腫瘤細胞較紫杉醇敏感細胞更容易釋放富含P-糖蛋白的外泌體。富含P-蛋白的外泌體可通過調(diào)節(jié)局部腫瘤微環(huán)境提高腫瘤細胞對阿霉素和紫杉醇的耐藥性[28]。因此，在卵巢癌患者耐藥性篩選生物新標記的開發(fā)中，外泌體具有較好的應(yīng)用前景。

2.3外泌體與卵巢癌治療 目前，手術(shù)治療和以順鉑為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療是卵巢癌的一線治療，但由于腫瘤細胞易對化療藥物產(chǎn)生耐藥，故卵巢癌的復(fù)發(fā)率較高，且分子靶向治療和免疫治療仍無法提高卵巢癌患者的5年生存率。

以RNA干擾為基礎(chǔ)的基因治療是基于小干擾RNA引起轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默技術(shù)，目前有研究致力于將其應(yīng)用于惡性腫瘤的治療。外泌體在人體體液循環(huán)中穩(wěn)定存在，且不引起免疫排斥，其作為遞送藥物的載體可提高抗腫瘤治療的成功率[29]。外泌體可保護RNA分子免受RNA酶、溫度等的影響。Reza等[30]研究發(fā)現(xiàn)，脂肪間充質(zhì)干細胞外泌體可通過傳遞miRNA抑制卵巢癌細胞的增殖，促進腫瘤細胞凋亡。外泌體可傳遞花青素，故花青素可提高卵巢癌的治療效果[31]。加載雷公藤的外泌體可抑制卵巢癌細胞的增殖以及腫瘤的生長，具有較好的腫瘤治療潛力[32]。綜上所述，外泌體可作為載體用于治療轉(zhuǎn)移性或復(fù)發(fā)性卵巢癌，但目前此研究尚處于起步階段，仍有待進一步的臨床研究。

腫瘤免疫治療是較新的腫瘤治療手段。外泌體具有調(diào)節(jié)免疫的生物學特性，故有望應(yīng)用于腫瘤免疫治療。樹突狀細胞可通過活化T細胞殺滅腫瘤細胞，研究發(fā)現(xiàn)，樹突狀細胞來源的外泌體可通過激活 T細胞和自然殺傷細胞增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用。目前，樹突狀細胞外泌體治療部分晚期惡性腫瘤正處于臨床試驗階段[33]。

外泌體在卵巢癌免疫治療中具有較好的應(yīng)用潛力，但目前尚無以外泌體為基礎(chǔ)的卵巢癌免疫治療研究的相關(guān)報道。某些類型的多肽物(如整合素結(jié)合肽)可通過結(jié)合卵巢癌來源的外泌體膜抑制受體細胞攝取外泌體[34]。外泌體的大小影響其在細胞間信息傳遞的速度，為其在治療領(lǐng)域的應(yīng)用提供了新的思路，外泌體有望成為卵巢癌免疫治療及靶向治療的有效靶點。

3 小 結(jié)

在婦科腫瘤中，卵巢癌的病死率最高，其發(fā)病機制未明。近年來，隨著對外泌體研究的不斷深入，外泌體的許多未知功能逐漸被發(fā)現(xiàn)。揭示外泌體在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用為開發(fā)卵巢癌診斷標志物以及開辟其治療新策略提供了新的思路。外泌體內(nèi)含有豐富的核酸、蛋白等生物活性分子，并廣泛存在于卵巢癌患者腹水及外周血循環(huán)中，對卵巢癌的早期診斷具有重要意義。在治療方面，外泌體的研究主要集中于調(diào)節(jié)外泌體的釋放、將外泌體作為載體進行藥物傳遞、以外泌體為靶點介導(dǎo)腫瘤靶向治療、基于外泌體的腫瘤免疫治療等方面。目前關(guān)于外泌體的大部分研究仍處于體外實驗或動物實驗階段，對其在人體內(nèi)表達及調(diào)控的研究較少。因此，外泌體與卵巢癌形成和進展關(guān)系及其在腫瘤診治的應(yīng)用有待進一步探究。