韓玉竹，李平蘭，何 琴，趙展展，劉雪文，楊葉梅,3,*

（1.莫南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 402460；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

抗菌肽是生物體自身產(chǎn)生的防御病原體入侵的小分子肽（通常分子質(zhì)量小于10 kDa），是生物體先天免疫重要組成部分，可拮抗細(xì)菌、病毒、原生動(dòng)物、絲狀真菌和酵母等[1-2]。植物和其他生物組織一樣，也會(huì)連續(xù)不斷地受到致病微生物的威脅，在致病微生物和自身的協(xié)同進(jìn)化下，推動(dòng)了植物自身防御機(jī)制的形成[3-4]。其中植物種子因含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，更容易協(xié)同進(jìn)化產(chǎn)生抗菌類物質(zhì)，抗菌肽就是其中的一類[5]。由于抗菌肽自身的蛋白質(zhì)特性、無污染性、發(fā)全性及抗菌特性，其在食品防腐保鮮、防腐劑替代研究和畜牧養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑的應(yīng)用研究具有優(yōu)勢，其科研和應(yīng)用潛力引起國內(nèi)外相關(guān)科學(xué)研究者和企業(yè)研發(fā)部的廣泛關(guān)注。

辣椒（Capsicum annuum L.）作為一種常用的調(diào)味品，在世界廣泛栽培。我國辣椒的種植面積約占所有蔬菜面積的10%，年產(chǎn)量高達(dá)2 800萬 t。但占其干果質(zhì)量30%～60%的辣椒籽，在加工過程中卻未被充分利用，造成資源浪費(fèi)[6]。據(jù)報(bào)道，辣椒籽中主要含膳食纖維、蛋白質(zhì)和脂肪，其中蛋白質(zhì)占其質(zhì)量分?jǐn)?shù)的17.30%左右，包含9 種必須氨基酸[7-8]。但是，我國辣椒種子蛋白的加工利用還有待開發(fā)。

近年來，網(wǎng)絡(luò)技術(shù)發(fā)展也非常的迅速，而在智能電網(wǎng)中的繼電保護(hù)裝置，其實(shí)本質(zhì)上也是一個(gè)計(jì)算機(jī)裝置，作用就是對系統(tǒng)進(jìn)行全面的監(jiān)控工作，對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的運(yùn)行進(jìn)行指導(dǎo)，讓智能電網(wǎng)的系統(tǒng)運(yùn)行能夠高效和安全。同時(shí)，繼電保護(hù)裝置在對電力信息的數(shù)據(jù)和故障信息進(jìn)行獲取的時(shí)候，會(huì)及時(shí)反饋信息到系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)控制中心。另外，隨著我國智能電網(wǎng)的發(fā)展越來越迅速，在自動(dòng)化程度方面，電力系統(tǒng)也做得越來越好，這樣就能夠保障了電力系統(tǒng)的安全和高效。

實(shí)驗(yàn)室前期開展植物源抗菌肽篩選時(shí)，發(fā)現(xiàn)辣椒籽抗菌肽具有廣譜抑制真菌的效果，尤其對谷類產(chǎn)品常見腐敗菌黃曲霉具有強(qiáng)烈的抑制作用。本研究在此基礎(chǔ)上優(yōu)化了辣椒籽抗菌肽的提取條件，并結(jié)合超濾離心、葡聚糖凝膠層析等步驟，以期得到純度較高的目標(biāo)產(chǎn)物，為辣椒籽以及植物源抗菌肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒籽品種分別為天鷹小椒、石竹紅、新化、子彈頭、印度椒和貴州燈籠椒，購于重慶市牧榮農(nóng)產(chǎn)品銷售有限公司。

供試菌株：前期從玉米中分離篩選獲得的黃曲霉（Aspergillus flavus）為莫南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.2 儀器與設(shè)備

BSY-200T直立式多功能粉碎機(jī) 永康市鉑歐五金制品有限公司；MYP11-2恒溫磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；EL104電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；2RH-250恒溫培養(yǎng)箱 中國雪柜實(shí)業(yè)有限公司；IKA漩渦振蕩器 廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；高速離心機(jī) 艾本德中國有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；冷凍干燥器 上海蘭儀實(shí)業(yè)有限公司；凝膠層析柱、DHL-1恒流泵、自動(dòng)部分回集器 上海青浦瀘莫儀器廠；垂直板電泳儀 北京百晶生物技術(shù)有限公司；凝膠成像分析系統(tǒng) 上海勤翔科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

2.2.4 硫酸銨飽和度對辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影響

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化

1.3.2 抑菌活性的測定

夏津縣北城水系生態(tài)水土保持工程的實(shí)施，使項(xiàng)目區(qū)的林木覆蓋率提高到15%，沙化和荒漠化情況得到了顯著改善，田園小氣候得到較大改善，農(nóng)副產(chǎn)品商品率提高，經(jīng)濟(jì)效益和生態(tài)效益、社會(huì)效益收益顯著，為沙化、荒漠化防治提供了成功經(jīng)驗(yàn)。

以黃曲霉為指示菌，采用牛津杯平板擴(kuò)散法測定辣椒籽蛋白提取物的抑菌活性[9]。將黃曲霉在PDA斜面上活化，待孢子長成后加入滅菌水，制成濃度為106個(gè)/mL的孢子懸浮液。移取1 mL孢子懸浮液到培養(yǎng)皿（直徑90 mm）中，倒入冷卻至45 ℃的PDA培養(yǎng)基20 mL，搖勻制備含菌平板。在含菌平板上放置滅菌的牛津杯，每個(gè)牛津杯里加入150 μL無菌蛋白提取液，28 ℃培養(yǎng)48 h后，測量抑菌圈直徑。

1.3.3 辣椒籽抗菌肽提取條件優(yōu)化

1.3.3.1 浸提液的選擇

參考植物種子抗菌肽提取的相關(guān)文獻(xiàn)，選用5 種浸提液：去離子水[10]、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS，0.02 mol/L，pH 7.4）、EDTA緩沖液（10 mmol/L Na2HPO4，15 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L KCl，1.5% EDTA，pH 5.4）[11-13]、Tris-HCl緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6）[14-15]、75%乙醇溶液。其他提取條件分別為：料液比1∶5（g/mL），4 ℃浸提12 h，硫酸銨飽和度70%。

1.3.3.2 料液比的選擇

分別選用1∶3、1∶5、1∶7、1∶9（g/mL）的料液比，在EDTA緩沖液中添加脫脂辣椒籽粉，4 ℃放置過夜后，飽和度70%硫酸銨沉淀，比較料液比對抗菌肽提取的影響。

1.3.3.3 浸提時(shí)間的選擇

6 種辣椒籽品種（天鷹小椒、石竹花、新化、子彈頭、印度椒和燈籠椒）的蛋白提取物均對黃曲霉生長具有抑制作用（表3）。不同品種辣椒籽的抑菌活性有差異，其中貴州燈籠椒和印度椒所含抗菌肽的抑菌效果顯著高于其他4 個(gè)品種。結(jié)合辣椒籽的獲取及經(jīng)濟(jì)成本，選擇燈籠椒辣椒籽作為研究材料，進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3.3.4 硫酸銨最佳飽和度的確定

參加捐款的干部職工紛紛表示，災(zāi)區(qū)群眾不會(huì)孤獨(dú)，水利系統(tǒng)的干部職工永遠(yuǎn)與災(zāi)區(qū)人民心連心，繼續(xù)為受災(zāi)地區(qū)群眾提供更多的支持和幫助。

結(jié)合上述最佳條件，對過濾后的辣椒籽浸提液分別加入不同飽和度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）的硫酸銨，測定沉淀產(chǎn)物等量溶液復(fù)溶后的抑菌圈直徑，以確定硫酸銨沉淀最適飽和度。

10 g辣椒籽粉碎后，用無水乙醚浸提過夜，去除粗脂肪。按料液比1∶5（g/mL）添加至乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）緩沖液中，4 ℃條件下浸提過夜。將浸出溶液用8 層紗布過濾，8 000 r/min離心15 min，取上清液按70%飽和度計(jì)量所需的固體硫酸銨量，研磨粉碎后緩慢加入，均勻攪拌至充分溶解，4 ℃靜止4 h，10 000 r/min離心15 min，沉淀用等體積（10 mL）去離子水復(fù)溶，過濾除菌，進(jìn)行后續(xù)抑菌活性的檢測。

2.2.2 料液比對辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影響

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels used for central composite design

1.3.5 模型的驗(yàn)證

對于 A 井，F(xiàn)B＝8·4m，GH＝153·9m，所以AB＝0·4m。A井長興組分層頂面為-5 140·4m，故氣水外邊界為-5 140.8m，選-5 140m；氣水內(nèi)邊界為-5 132.4m，選-5 130m。

采用響應(yīng)面法優(yōu)化辣椒籽抗菌物質(zhì)的提取工藝，并根據(jù)優(yōu)化后的條件參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3.6.2 凝膠色譜層析

1.3.6 抗菌肽的分離純化

1.3.6.1 抗菌肽脫鹽及粗分離

人脫離不了社會(huì)團(tuán)體而存在，猶如人類無法避開自然規(guī)律的限制，人是自然的產(chǎn)物同樣也是社會(huì)的構(gòu)成，人不可能脫離外在世界而獨(dú)自存在。“每個(gè)人的自由發(fā)展是一切人自由發(fā)展的條件”[21]，反之只有在集體自由之中才能體驗(yàn)自我的自由。人若獨(dú)立于社會(huì)集體之外，反而獲得的是一種茫然失據(jù)的孤獨(dú)與空虛。自由何為？人類的生存、自由與發(fā)展在集體中的共同交涉下才能夠把握與實(shí)現(xiàn)，把外界屏蔽于自我之外的個(gè)體，只是將自由與自我割裂。社會(huì)文明給人類帶來的是狹小的空間與拘束感，體育則是給予人類歡騰的場域與無束縛感。體育讓人類在公共空間中集體釋放天性、呈現(xiàn)自我。

對辣椒籽抗菌肽粗提物復(fù)溶后，1 kDa透析袋4 ℃透析24 h，期間換液3～4 次，除去小分子糖、鹽等。將透析后的提取液加入10 kDa超濾管，5 000 r/min離心1 h，分別回集超濾管上面的截流液和下面的管底液，檢測其抑菌活性，真空冷凍干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 結(jié)局指標(biāo) ①上消化道出血發(fā)生率；②病死率；③血鈣濃度；④血磷濃度；⑤血鎂濃度；⑥甲狀旁腺激素（PTH）水平；⑦堿性磷酸酶（AKP）水平；⑧血肌酐水平；⑨腎小球?yàn)V過率。

新課標(biāo)對課堂教學(xué)的要求就是教學(xué)活動(dòng)的有效性和高效性，而創(chuàng)新思維的培養(yǎng)是實(shí)施高效課堂的根本。我們的任務(wù)首先就是培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維，努力提升學(xué)生的領(lǐng)悟水平。培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識和創(chuàng)新能力，就要培養(yǎng)學(xué)生敏銳的觀察力、高效持久的記憶力、創(chuàng)造性的思維能力、操作能力、頑強(qiáng)的毅力、豐富的想象力等。我們要不斷引導(dǎo)學(xué)生領(lǐng)悟問題，在常規(guī)方法行不通時(shí)，也有特殊方法讓我們解決問題，培養(yǎng)意志品質(zhì)和信心決心。課堂教學(xué)中教學(xué)方式和教學(xué)內(nèi)容的革新，是當(dāng)今教學(xué)改革的必需。教師要積極指導(dǎo)學(xué)生運(yùn)用已有知識，運(yùn)用已有能力去進(jìn)行創(chuàng)造性思維活動(dòng)，通過不斷歷練，達(dá)到學(xué)會(huì)學(xué)習(xí)的境地，為他們的思維發(fā)展插上飛翔的翅膀。

采用填料葡聚糖凝膠G-50進(jìn)行凝膠層析，用去離子水對柱子進(jìn)行平衡，直到檢測洗脫液pH值恒定時(shí)為止。將超濾離心后回集到的抑菌效果好的目標(biāo)產(chǎn)物配制成10 mg/mL溶液，濾膜（0.45 μm）過濾后按5 mL的加樣體積進(jìn)行上樣。用去離子水洗脫樣品，恒流泵設(shè)定恒速為20 r/min，50 min/管，每管約4 mL，洗脫時(shí)間為250 min。

將緩沖器軸向力減去阻尼力，獲得氣彈力和摩擦力；繪制“緩沖系統(tǒng)行程—?dú)鈴椓湍Σ亮Α鼻€，與靜壓曲線進(jìn)行對比，根據(jù)兩條曲線的差異情況確定起落架緩沖功能是否異常，如果異常，根據(jù)異常出現(xiàn)的起始點(diǎn)確認(rèn)異常時(shí)的緩沖器行程，并記錄起落架載荷。

1.3.6.3 樣品回集

紫外檢測波長為280 nm，逐管檢測蛋白質(zhì)含量，根據(jù)檢測值，分別回集出現(xiàn)波峰時(shí)所對應(yīng)的組分，冷凍干燥。用去離子水制備適當(dāng)濃度進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，以確定目標(biāo)樣品。

1.3.6.4 Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，Tricine-SDS-PAGE）檢測抗菌肽分子質(zhì)量

表2 電泳膠配方Table 2 Compositions of separating and stacking gels

將通過Sephadex G-50色譜柱分離純化獲得的目標(biāo)樣品用去離子水復(fù)溶，配制合適的濃度。取20 μL目標(biāo)樣品與5 μL上樣緩沖液混合，在水浴中煮沸5 min，然后置冰浴中快速冷卻。根據(jù)表2的配方制備濃縮膠（15.5%）、夾層膠（10%）和分離膠（4%），3 種膠的制膠體積比為4∶1.5∶1。

取超低分子質(zhì)量蛋白Marker 10 μL、待測樣品20 μL分別上樣，電泳時(shí)，先設(shè)定30 V電壓，待樣品進(jìn)入分離膠上沿時(shí)，電壓調(diào)至100 V，直至溴酚藍(lán)距離膠底部1 cm左右時(shí)停止電泳，整個(gè)電泳時(shí)間大約需要4～5 h。電泳結(jié)束后，將凝膠浸入5%戊二醛固定液中固定20 min，然后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色液搖床染色40～60 min，用蒸餾水洗滌凝膠，脫色液脫色后，凝膠成像儀照相保存。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel處理并運(yùn)用SPSS 20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同品種辣椒籽蛋白提取物對黃曲霉的抑菌活性

將脫脂后的辣椒籽粉以1∶5（g/mL）的料液比與EDTA緩沖液混合后，于4 ℃分別浸提4、8、12、16、20、24 h，比較浸提時(shí)間對辣椒籽抗菌物質(zhì)提取的影響。

表3 不同品種辣椒籽抗菌肽對黃曲霉的抑菌活性Table 3 Antifungal activities of antimicrobial peptides from seeds of different varieties of hot pepper against A. fl avus

2.2 抗菌肽提取條件的優(yōu)化

2.2.1 緩沖液的選擇對抗菌肽提取的影響

如圖1所示，幾種浸提液浸提后獲得的抗菌肽均對黃曲霉生長具有抑制作用。其中EDTA緩沖液浸提后的抑菌圈直徑顯著大于其他幾組（P＜0.05），因此后續(xù)試驗(yàn)選用EDTA緩沖液進(jìn)行。

圖1 不同緩沖液對抗菌肽抑菌活性的影響Fig. 1 Effect of different extraction buffers on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取影響抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的3 個(gè)因素（料液比、浸提時(shí)間、硫酸銨飽和度）為自變量，抑菌圈直徑為響應(yīng)值，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法，設(shè)置3因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素與水平見表1。

圖2 料液比對抗菌肽抑菌活性的影響Fig. 2 Effect of solid-to-solvent ratio on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

由圖2可知，當(dāng)料液比為1∶5（g/mL）時(shí)，提取物的抑菌圈直徑顯著大于其他幾組（P＜0.05），效果最好，因此，后期響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)選用1∶5（g/mL）料液比作為中心試驗(yàn)點(diǎn)。

2.2.3 浸提時(shí)間對辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影響

圖3 浸提時(shí)間對抗菌肽抑菌活性的影響Fig. 3 Effects of extraction time on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

如圖3所示，隨著浸提時(shí)間的延長，抗菌產(chǎn)物的得率增加，當(dāng)浸提時(shí)間為16 h時(shí)，提取率最大，當(dāng)浸提時(shí)間大于16 h，抑菌圈直徑略有減小，但差異不顯著（P＞0.05）。因此，確定抗菌肽最適浸提時(shí)間應(yīng)控制在16 h左右，并選擇其為下一步響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

1.3.1 辣椒籽蛋白提取物的制備

由圖4可知，隨著硫酸銨飽和度的升高，其沉淀所得物對黃曲霉菌的抑菌圈直徑越大，但當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到80%時(shí)，沉淀出的抑菌產(chǎn)物與90%飽和度硫酸銨的抑菌效果無顯著差異（P＞0.05），綜合考慮得率和硫酸銨用量，選擇80%飽和度的硫酸銨為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心試驗(yàn)點(diǎn)。

圖4 硫酸銨飽和度對抗菌肽抑菌活性的影響Fig. 4 Effects of ammonium sulfate saturation on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

2.3 辣椒籽抗菌肽提取條件的響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 回歸模型的建立

表4 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Central composite design with experimental results

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果如表4所示，使用Design Expert 8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得辣椒籽抗菌肽的抑菌圈直徑（Y）對料液比（A）、浸提時(shí)間（B）、硫酸銨飽和度（C）的多項(xiàng)回歸方程：

2.3.2 回歸模型方差分析

將以上回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表5所示。模型回歸極顯著（P=0.001 0），失擬檢驗(yàn)不顯著（P=0.428 79），說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾較小。另外，模型的決定系數(shù)R2為0.949 3，表明方程與實(shí)際的測試數(shù)據(jù)吻合良好，較好反映了抗菌肽抑菌圈直徑與料液比、浸提時(shí)間、硫酸銨飽和度的關(guān)系，因此，該模型可用于分析和預(yù)測辣椒籽抗菌肽的提取條件。通過F檢驗(yàn)確定回歸方程中每個(gè)變量對響應(yīng)值影響的顯著性，模型一次項(xiàng)A、B、C不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2均處于極顯著水平；交互項(xiàng)AB、AC、BC均不顯著。

表5 擬合二次多項(xiàng)式模型的方差分析Table 5 Analysis of variance (ANOVA) for the fitted quadratic polynomial model

2.3.3 響應(yīng)面分析

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 運(yùn)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)和描述性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量采用Logistic多因素進(jìn)行逐步回歸分析。重復(fù)測量的計(jì)量資料采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

根據(jù)回歸方程制作的響應(yīng)面立體分析圖和等高線圖如圖5所示，分別反映了3 個(gè)因素（料液比、浸提時(shí)間、硫酸銨飽和度）兩兩交互作用對響應(yīng)值的影響。從方程可以看出，二次項(xiàng)的系數(shù)都是負(fù)數(shù)，以它為特征的拋物面開口方下，具有極大值點(diǎn)。通過Design Expert 8.0.6.1軟件分析，辣椒籽抗菌肽最佳提取條件為料液比1∶5.05（g/mL）、浸提時(shí)間16.13 h、硫酸銨飽和度81.15%，在此條件下抗菌肽的抑菌圈直徑為23.77 mm。

圖5 各因素對辣椒籽抗菌肽抑菌活性影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of various factors on the activity of antifungal peptides from hot pepper seeds

2.3.4 回歸模型的驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測值，將優(yōu)化確定的提取條件進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)6 次，結(jié)果顯示抗菌肽的抑菌圈直徑平均值為23.89 mm，與預(yù)測值擬合率為99.49%，表明預(yù)測值和實(shí)際值吻合良好，優(yōu)化模型可靠。優(yōu)化后抗菌肽活性比優(yōu)化前（12.34 mm）提高了93.60%，表明本實(shí)驗(yàn)所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)合理有效，獲得的提取條件可以顯著提高抗菌肽的得率。

2.4 抗菌肽的分離純化

2.4.1 抗菌肽脫鹽及粗分離

3）主控芯片發(fā)送AT+NSOST指令，BC95模組發(fā)送數(shù)據(jù)至云服務(wù)器，指令中需填入云服務(wù)器的IP地址、端口號、待發(fā)送的數(shù)據(jù)長度和數(shù)據(jù)。

目前，國家對于區(qū)域創(chuàng)新的體制較為成熟，建立了較為健全的機(jī)制，但是在區(qū)域創(chuàng)新能力比較優(yōu)勢的研究上較為薄弱，尚未有遼寧地區(qū)獨(dú)特的指標(biāo)體系。朱玉春、付輝輝利用專利授權(quán)量描述區(qū)域創(chuàng)新能力，以我國八區(qū)域劃分理論為基礎(chǔ)，通過1996年-2005年的相關(guān)數(shù)據(jù)分析認(rèn)為我國區(qū)域創(chuàng)新能力差異呈擴(kuò)大趨勢。甄峰曾在2000年提出以知識創(chuàng)新能力和技術(shù)創(chuàng)新能力為基礎(chǔ)和核心的評價(jià)體系，具體指標(biāo)如表：

將辣椒籽抗菌肽用透析袋脫鹽處理后，再使用10 kDa的超濾管超濾離心，使辣椒籽抗菌肽達(dá)到粗分離目的，分別檢測小于10 kDa組分和大于10 kDa組分的抑菌效果，選擇具有良好抑菌效果的組分（＜10 kDa）進(jìn)行下一步分離純化。

2.4.2 葡聚糖凝膠柱層析

將10 kDa超濾管超濾后抑菌效果好的組分用葡聚糖凝膠G-50柱層析，以實(shí)現(xiàn)分離純化的目的。通過上樣量5 mL；流速20 r/min；洗脫時(shí)間250 min，在波長280 nm測定吸光度。如圖6所示，分別回集3 組分峰，以黃曲霉為指示菌，分別檢測各組分的抑菌活性。結(jié)果顯示組分3的抑菌效果最好，確定組分3為目標(biāo)樣品。因組分2和組分3的峰有少部分重疊，為保障目標(biāo)樣品的純度，通過不回集與組分2重疊的回集管，并對目標(biāo)抗菌肽樣品進(jìn)行二次柱層析純化，冷凍干燥后進(jìn)行后續(xù)分子特性檢測。

圖6 凝膠層析結(jié)果Fig. 6 Gel chromatography of antifungal peptides from hot pepper seeds

2.4.3 目標(biāo)樣品的分子質(zhì)量測定

將葡聚糖凝膠柱-G50柱層析分離得到目標(biāo)樣品使用Tricine-SDS-PAGE檢測其純度和分子質(zhì)量大小。如圖7所示，抗菌肽只有一條清晰條帶，說明純化效果較好，通過和超低分子質(zhì)量蛋白質(zhì)Marker對比可估計(jì)其分子大小在7.8 kDa左右。

圖7 Tricine-SDS-PAGE檢測結(jié)果Fig. 7 Results of Tricine-SDS-PAGE

3 討 論

發(fā)全、高效天然生物防腐劑的開發(fā)逐漸成為農(nóng)產(chǎn)品防腐保鮮領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[16-17]。植物抗菌肽是植物屏障防御系統(tǒng)的重要組成部分[18-19]。目前已從許多植物種類的種子、花、根和葉中分離出對農(nóng)產(chǎn)品腐敗菌、植物病原菌以及人類致病菌有活性的抗菌肽[20-24]。因此，植物抗菌肽被認(rèn)為是具有重要應(yīng)用前景的抗菌類化合物。

韓玉竹等[9]通過對解淀粉芽孢桿菌H15所產(chǎn)抗菌肽的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了比優(yōu)化前高53.48%的優(yōu)化條件。胡欣蕾等[25]以花臉香蘑菌絲體為原料，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化花臉香蘑菌絲體多糖提取條件，使花臉香蘑菌絲體多糖的提取率由最低的3%左右提高到15.79%。天然抗菌肽的提取方法目前有硫酸銨沉淀法、堿溶酸沉法和有機(jī)溶劑提取等。其中最常用于植物源抗菌肽的是硫酸銨沉淀法[8,26-27]，因?yàn)榱蛩徜@溶解性好，能形成高鹽環(huán)境，有利于蛋白沉淀，同時(shí)在純化過程中不會(huì)影響蛋白活性。然而，由于原料理化特性差異，提取工藝也不同。目前還鮮有辣椒籽抗菌肽提取工藝的報(bào)道。因此，本研究依據(jù)前人的工作基礎(chǔ)，考察不同浸提液、料液比、浸提時(shí)間、硫酸銨飽和度對辣椒籽抗菌肽提取的影響。首先應(yīng)用單因素試驗(yàn)，初步評價(jià)各因素對辣椒籽抗菌肽的提取效果，然后進(jìn)一步在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對主要影響因素（料液比、浸提時(shí)間、硫酸銨飽和度）進(jìn)行優(yōu)化和評價(jià)，建立辣椒籽抗菌肽提取條件的二次多項(xiàng)式回歸模型，并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對該模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。通過對該模型進(jìn)行求導(dǎo)和解矩陣可知，脫脂辣椒籽粉按料液比1∶5.05（g/mL）加入到EDTA緩沖液中浸提16.13 h后取上清液，添加81.15%飽和度的硫酸銨可以獲得較大的得率，預(yù)測值為23.77 mm。在此條件下再進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到抗菌物質(zhì)抑菌抑菌圈直徑23.89 mm/150 μL，與預(yù)測值擬合率達(dá)99.49%，比優(yōu)化前（12.34 mm）提高了93.60%。說明本研究所確定的優(yōu)化方案的設(shè)計(jì)合理有效，獲得的提取條件能夠明顯提高抗菌肽產(chǎn)量。

抗菌肽的分離純化主要是基于原料的物理化學(xué)性質(zhì)，通常包括超濾、凝膠過濾層析、離子交換層析等分離步驟。在實(shí)際操作中，為達(dá)初步或精確分離的目的，一般會(huì)選擇2 種或更多種純化方法[28]。姜太玲[29]將花椒籽抗菌肽經(jīng)過10 kDa和5 kDa的超濾管進(jìn)行分段分離后再選擇抑菌效果最好的組分過葡聚糖凝膠柱層析，獲得達(dá)到電泳純的目的樣品。王戰(zhàn)勇等[30]發(fā)現(xiàn)使用葡聚糖凝膠-G50和葡聚糖凝膠G-25串聯(lián)凝膠層析的效果明顯比只使用葡聚糖凝膠G-50的效果好。本研究通過10 kDa超濾粗分離后，選擇抑菌效果好的組分過葡聚糖凝膠G-50柱層析，純化后的抗菌肽經(jīng)Tricine-SDSPAGE檢測已達(dá)到電泳純，分子質(zhì)量在7.8 kDa左右，說明辣椒籽蛋白提取物的主要抑菌成分為抗菌肽。研究結(jié)果可為后續(xù)辣椒籽抗菌肽基本特性研究及抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供參考依據(jù)。

10.為加快浦東新區(qū)建設(shè)，提供開發(fā)、投資的必要基礎(chǔ)設(shè)施，浦東新區(qū)新增財(cái)政收入，將用于新區(qū)的進(jìn)一步開發(fā)。

（1）社會(huì)團(tuán)體財(cái)產(chǎn)權(quán)。社會(huì)團(tuán)體法人財(cái)產(chǎn)觀認(rèn)為行業(yè)協(xié)會(huì)商會(huì)、工會(huì)、宗教組織等社會(huì)團(tuán)體應(yīng)對合法所得享有財(cái)產(chǎn)權(quán)，政府或個(gè)人等投入社會(huì)團(tuán)體的資源不應(yīng)視為投資行為而享有任何財(cái)產(chǎn)權(quán)利。如賈西津（2016）認(rèn)為“將行政支持誤當(dāng)成行政投資……易形成國有資產(chǎn)的不當(dāng)擴(kuò)大化”，建議采用“行業(yè)協(xié)會(huì)資產(chǎn)”這一政策性概念。沈永東、宋曉清（2016）提出，行業(yè)協(xié)會(huì)商會(huì)脫鉤改革要確保行業(yè)協(xié)會(huì)商會(huì)真正擁有獨(dú)立自主權(quán)，擁有獨(dú)立的社團(tuán)法人地位，政府不應(yīng)干涉行業(yè)協(xié)會(huì)商會(huì)獨(dú)立自主開展活動(dòng)。