王春艷，李宇輝*，李應(yīng)彪,*，李寶坤，王騰斌，石秀如

（1.石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆 石河子 832003；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，新疆 石河子 832000）

新疆奶酪又稱為奶疙瘩，是哈薩克族、蒙古族等少數(shù)民族喜歡食用的一種乳制品，哈薩克語稱奶疙瘩為庫魯特（Kurut）[1]。Kurut的生產(chǎn)環(huán)境與波蘭奶酪[2]非常相似，通常不使用發(fā)酵劑，僅由牛奶本身和環(huán)境中存在的微生物群通過自然發(fā)酵形成[3]。隨著便攜方便食品種類的日益豐富以及現(xiàn)代化生活方式不斷方牧區(qū)滲透，使得傳統(tǒng)奶酪的種類和加工量不斷減少，其中蘊藏的微生物資源也逐漸消失。因此，對傳統(tǒng)奶酪中微生物多樣性的研究將有助于保護(hù)其中的微生物資源。

奶酪營養(yǎng)價值極高，但我國居民對奶酪、黃油等高附加值乳品消費極少[4]，主要原因之一為奶酪的感官品質(zhì)較差[5]。眾多研究發(fā)現(xiàn)，奶酪中的微生物主要包括乳酸菌[6-8]、酵母菌[9]以及霉菌[10-11]等三大類群，其中乳酸菌對奶酪感官品質(zhì)的改善發(fā)揮著重要作用。有研究表明，乳酸菌在奶酪發(fā)酵初期產(chǎn)生的酸性物質(zhì)有利于奶酪凝固[12]，并能促進(jìn)干酪的成熟，提高干酪營養(yǎng)及強化風(fēng)味物質(zhì)的產(chǎn)生[13]。此外，乳酸菌在改善奶酪質(zhì)地、拉伸性、氣孔形成以及抑制病原微生物生長等方面也發(fā)揮著重要作用[14-15]。除乳酸菌之外，奶酪中含有的其他細(xì)菌微生物群如丙酸桿菌、凝固酶陰性葡萄球菌、哈夫尼菌以及某些需氧放線菌等也有助于奶酪風(fēng)味和顏色的形成[16-17]。高通量測序技術(shù)作為近年來新興的分子生物學(xué)技術(shù)，已被廣泛應(yīng)用于土壤、食品及動物腸道等樣本微生物多樣性的研究[18]，它能夠?qū)悠分袕?fù)雜和低豐度的微生物群落進(jìn)行全面覆蓋，在屬甚至種水平上分析微生物群落多樣性[19]；而傳統(tǒng)培養(yǎng)法作為微生物鑒定的經(jīng)典方法，可將分離出的微生物進(jìn)行后續(xù)研究及應(yīng)用。

伊犁傳統(tǒng)奶酪屬于自然發(fā)酵乳制品，其中蘊含的微生物種類繁多，目前采用高通量測序技術(shù)結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法研究奶酪中微生物多樣性的報道相對較少[20]，且很少有人對伊犁牧區(qū)手工奶酪中的微生物進(jìn)行研究。因此，本研究在采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù)對奶酪中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合傳統(tǒng)培養(yǎng)法對奶酪中的乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，并根據(jù)其16S rRNA基因序列對其進(jìn)行功能預(yù)測分析，旨在探明伊犁地區(qū)傳統(tǒng)奶酪中微生物種類及其基因功能信息，為挖掘和保護(hù)其中的微生物資源提供保障，同時為評估傳統(tǒng)奶酪的發(fā)全性提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

14 種奶酪樣品分別采自新疆阿勒泰、北屯及額敏地區(qū)的牧民家，樣品經(jīng)無菌采樣袋密封好后用4 ℃便捷式冰箱立即運往實驗室貯存于-20 ℃冰箱，在24 h內(nèi)進(jìn)行實驗。阿勒泰地區(qū)的奶酪樣品編號為B6、B7、T1及T2，北屯地區(qū)的奶酪樣品編號為B1、B2、B3及B4，額敏地區(qū)的樣品編號為E1、E2、E3、E4、E5及E6。

MRS培養(yǎng)基、營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基、醋酸鉛培養(yǎng)基、硝酸鹽培養(yǎng)基、半固體瓊脂培養(yǎng)基 青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌DNA提取試劑盒 美國Biomiga公司；2×Taq Master Mix (Dye Plus) 南京諾唯贊生物科技有限公司；瓊脂糖 莫班牙Biowest公司；Magnetic Soil And Stool DNA Kit試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

22331型高速冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf AG公司；HP1020凝膠成像系統(tǒng)、T100型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國Bio-Rad公司；CX23LEDRFS1C生物顯微鏡 奧林巴斯（廣州）工業(yè)有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申發(fā)醫(yī)療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)菌多樣性分析

采用Magnetic Soil And Stool DNA Kit試劑盒提取樣品總DNA，每個樣品3 個平行，利用NanoDrop2000型微量紫外分光光度計檢測DNA的濃度及純度。PCR擴(kuò)增引物為：27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和533R（5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’），PCR體系為：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L），0.4 μL FastPfu Polymerase，0.2 μL BSA，10 ng Template DNA補dd H2O至20 μL。程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)數(shù)為27，72 ℃最終延伸10 min。擴(kuò)增結(jié)束后，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的純度。使用凝膠回回試劑盒切膠回回PCR產(chǎn)物進(jìn)行文庫構(gòu)建后，在Illumina MiSeq PE 300平臺上進(jìn)行高通量測序分析。參照田建軍等[21]的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及繪圖，并運用PICRUSt軟件對樣品中的微生物進(jìn)行16S rRNA功能預(yù)測分析。

1.3.2 乳酸菌多樣性分析

1.3.2.1 菌株的分離、純化

將奶酪置于無菌條件下用研缽將樣品充分研碎并混勻，取適量研碎的樣品置于50 mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)24 h。吸取1 mL擴(kuò)增培養(yǎng)液用生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，每次稀釋均需用移液槍把液體充分混勻并更換無菌槍頭。分別吸取10-3～10-5梯度的稀釋液100 μL稀釋液均勻涂布于MRS培養(yǎng)基中，每個梯度做4 個平行，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行劃線培養(yǎng)，重復(fù)劃線多次，直至用顯微鏡觀察至純種，記錄其菌落、細(xì)胞形態(tài)。將純化后的乳酸菌用50%甘油-菌液（1∶1，V/V）于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.2 生理生化實驗鑒定

樣品中乳酸菌的生理生化鑒定實驗按照文獻(xiàn)[22-23]的方法，包括：菌落及細(xì)胞形態(tài)的觀察、過氧化氫實驗、革蘭染色實驗、明膠液化實驗、硫化氫實驗、硝酸鹽還原實驗、運動性實驗、耐鹽性實驗、pH 4.5生長實驗以及糖發(fā)酵實驗。

1.3.2.3 16S rDNA測序鑒定

采用美國Biomiga公司的細(xì)菌gDNA提取試劑盒分離菌株基因組DNA，具體步驟按照說明書進(jìn)行，使用微量核酸定量儀檢測基因組D N A濃度以及純度（OD260nm/OD280nm）。擴(kuò)增引物為27F（5’-AGAGTTTGATMTGGCTCAG-3’），1492R（5’- TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’）。PCR擴(kuò)增體系（50 μL）及條件：上下游引物各2.0 μL，模板2.0 μL，2×TaqMaster Mix 25 μL，Nuclease-free Water 19 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)30 次，72 ℃最終延伸5 min，-20 ℃保存。取5 μL的PCR產(chǎn)物加入到1%的瓊脂糖凝膠（含0.01%的goldviewII型核酸染色劑）點樣孔中，在電壓100 V、電流90 mA、電泳液為1×TAE緩沖液中電泳40 min。將符合測序要求的PCR產(chǎn)物寄往測序公司進(jìn)行測序操作，所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST比對，將測序菌株與模式菌株同源性大于99%的序列利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，數(shù)據(jù)自展重抽樣次數(shù)1 000 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶酪中細(xì)菌多樣性分析

2.1.1 細(xì)菌序列信息及α多樣性

常用到的α多樣性指數(shù)包括豐富度指數(shù)（Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)）、多樣性指數(shù)（Simpson指數(shù)、Shannon指數(shù)）以及群落覆蓋度指數(shù)Coverage等[24]。本研究中所得到的奶酪樣品序列信息及α多樣性指數(shù)如表1所示，14 份奶酪樣品共得到的細(xì)菌原始序列為561 955 條，質(zhì)控過濾后得到的有效序列為545 560 條。在物種豐度上，阿勒泰地區(qū)T2樣品的Sobs和Chao1指數(shù)最大，說明其細(xì)菌數(shù)目最多，且與其他樣品差異顯著；阿勒泰地區(qū)B7和額敏地區(qū)E2樣品的Sobs和Chao1指數(shù)較小，其細(xì)菌數(shù)目較少，B7與E2樣品的Sobs指數(shù)無顯著差異，但其Chao1指數(shù)存在顯著差異。在物種多樣性上，樣品T2的Simpson指數(shù)最小，Shannon指數(shù)最大，說明其細(xì)菌多樣性最高，且與其他樣品有顯著差異；樣品B7的Simpson指數(shù)最大，Shannon指數(shù)最小，說明其細(xì)菌多樣性最低。14 份樣品的Coverage指數(shù)均接近于1，說明樣品中的序列基本都被完全測出，測序結(jié)果能夠充分反映樣品中的細(xì)菌多樣性，但B7樣品的Coverage指數(shù)與其他樣品差異顯著。

表1 14 份奶酪樣品的序列信息及α多樣性指數(shù)Table 1 Sequence information and α diversity values of 14 traditional cheeses samples

2.1.2 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

圖1 屬（a）和種（b）水平下的細(xì)菌群落組成Fig. 1 Relative abundance of bacteria at genus (a) and species (b) levels from all cheese samples

在細(xì)菌屬水平上（圖1a），14 份奶酪共測出29 種相對豐度大于2%的屬，相對豐度排名前10的細(xì)菌屬依次雷爾氏菌屬（Ralstoniaspp. 30.41%）、乳桿菌屬（Lactobacillusspp. 9.17%）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp. 6.32%）、不動桿菌屬（Acinetobacterspp.4.62%）、醋酸桿菌屬（Acetobacterspp. 3.98%）、腸球菌屬（Enterococcusspp. 3.15%）、厭氧芽孢桿菌屬（Anoxybacillusspp. 2.96%）、志賀氏菌屬（Escherichia-Shigellaspp. 2.92%）、norank_c__Cyanobacteria（2.67%）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.2.61%），這與Dalmasso等[25]報道的Ralstoniaspp.在奶酪中并不常見或者含量極低（0.01%～0.000 1%）的結(jié)果并不一致。目前，關(guān)于Ralstoniaspp.在食品中存在的報道并不多，Soto等[26]利用高通量測序技術(shù)研究驢奶中的細(xì)菌多樣性時，發(fā)現(xiàn)其中的優(yōu)勢細(xì)菌屬為Pseudomonasspp.、Ralstoniaspp.、Acinetobacterspp.，由于伊犁傳統(tǒng)手工奶酪制作過程中沒有添加外源發(fā)酵劑，因此考慮奶酪中的Ralstoniaspp.可能來源于原料乳。Selvasankar等[27]利用高通量測序技術(shù)分析了墨莫哥奶酪中的細(xì)菌群落，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Streptococcusspp.、Lactococcusspp.、Lactobacillusspp.、Aerococcusspp.和Weisellaspp.是主要菌群，本研究與其相同之處在于奶酪中均存在Streptococcusspp.、Lactobacillusspp.、Weisellaspp.、Lactococcusspp.，而未發(fā)現(xiàn)Aerococcusspp.；這說明上述共同菌群是大部分傳統(tǒng)手工奶酪中的常見菌種，但由于制作手法及氣候條件的不同可能會導(dǎo)致奶酪中的微生物群落結(jié)構(gòu)有所差異。

在細(xì)菌種水平上（圖1b），14 份奶酪共測出39 種相對豐度大于2%的種，大部分都屬于unidentified（24.38%）、unclassified（16.75%）和uncultured（10.63%），能準(zhǔn)確鑒定到種的只有瑞士乳桿菌（L. helveticus3.06%）、蘋果醋桿菌（Acetobacter malorum3.01%）、大腸埃希氏桿菌（Escherichia coli2.97%）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis1.64%）、Halomonas desiderata（1.54%）、埃氏慢生根瘤菌（Bradyrhizobium elkanii1.38%）、皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii1.33%）、產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes1.18%）、巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus1.01%）、瓊氏不動桿菌（Acinetobacter junii0.71%）、赫曼尼腸球菌（Enterococcus hermanniensis0.4%）、Acinetobacter tandoii（0.21%）。HTS結(jié)果顯示出奶酪樣品中的優(yōu)勢乳酸菌種為L.helveticus，且大部分存在于額敏地區(qū)的E1樣品中，說明不同地區(qū)或不同樣品中的優(yōu)勢菌種存在明顯差異[28]。本研究結(jié)果顯示出Illumina MiSeq測序技術(shù)在種水平上的鑒定能力較差，無法將大多數(shù)微生物鑒定到種水平，這與陳澤斌等[29]的描述結(jié)果一致。

2.1.3 不同樣品細(xì)菌群落組成差異

圖2 基于Weighted UniFrac的不同樣品PCoA圖（a）及樣本菌群分型分析圖（b）Fig. 2 PCoA plot (a) and bacterial classification plot (b) of cheese samples at genus level based on weighted UniFrac

14 份奶酪樣品盡管其原材料均為牛奶且制作過程中也均未添加任何外源發(fā)酵劑，但由于其制作工藝、生產(chǎn)溫度及奶源本身微生物種類的差異[30]等原因，14 份奶酪的細(xì)菌群落組成也會有所差異。從PCoA圖（圖2a）可以看出，14 份奶酪樣品的細(xì)菌群落組成大致可以分為2 個類型：其中B2、B3、E5和E6樣品在圖中的分布較為集中，說明這4 份樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)較為相似。結(jié)合圖1a可以看出，這4 個樣品都含有豐度較大的Ralstonia spp.，且其菌群組成及相對豐度差異也都較小。另外10 個樣品在圖中的分布較為分散，說明這10 個樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。這10 個樣品中雖然B1、B6、E2、E3及E4樣品的優(yōu)勢菌群均為Ralstonia spp.，B7和E1的優(yōu)勢菌群為Lactobacillus spp.，但其他菌群組成及相對豐度差異較大；其余3 個樣品的優(yōu)勢菌群不僅各有不同，而且其他菌群組成及相對豐度也都差異較大（圖1a）。

從樣本菌群分型分析圖（圖2b）可以看出，14 份奶酪樣品根據(jù)其菌群組成的不同可以分為2 個大型類群和6 個小型類群。2 個大型類群中B1、B2、B3、E3、E5及E6聚成了一個類群且于E4的距離較近，E2和B6聚成了另外一個類群但與B1形成的類群具有重疊之處。結(jié)合圖1可以看出，B1、B2、B3、B6、E2、E3、E4、E5及E6樣品中的優(yōu)勢菌群均為Ralstonia，但B6和E2除含有豐富的Ralstonia，其余菌群組成和豐度都與其他樣品存在差異，故E4與B1形成的類群之間的距離較近，而B6與E2單獨形成了一個類群。其余5 個樣品形成的5 個單獨類群不僅優(yōu)勢菌群各不相同而且菌群組成差異較大，故在圖中各自形成了單獨類群且距離較遠(yuǎn)。

2.1.4 不同地區(qū)樣品細(xì)菌種類差異分析

不同地區(qū)樣品中的微生物組成會隨著地域環(huán)境及樣品制作方法的不同而有所差異[31]。本研究利用Venn圖對3 個地區(qū)樣品中所含有的微生物種類在屬和種水平上進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示不同地區(qū)樣品中存在的微生物種類差異較為明顯。在細(xì)菌屬水平上（圖3a），額敏、阿勒泰和北屯3 個地區(qū)14 份樣品中所含有的細(xì)菌總數(shù)為493 種，其中3 個地區(qū)特有的細(xì)菌種數(shù)依次為62、171、60 種，共有的細(xì)菌種數(shù)為100 種，占細(xì)菌總數(shù)的12.6%。在細(xì)菌種水平上（圖3b），3 個地區(qū)所含有的細(xì)菌總數(shù)為780 種，其中額敏、阿勒泰和北屯地區(qū)特有的乳酸菌種類依次為102、320、124 種。綜上可知，在屬和種兩個分類學(xué)水平上，阿勒泰地區(qū)奶酪中的微生物種類最為豐富，而額敏地區(qū)奶酪中的微生物種類較少。Jin Hao等[32]利用PacBio測序技術(shù)研究了來自Buryatian 7 份手工奶酪中的細(xì)菌多樣性，結(jié)果顯示7 份奶酪共存在82 個細(xì)菌屬和145 個細(xì)菌種，優(yōu)勢細(xì)菌屬為Lactococcus（51.46%）和Streptococcus（17.81%），這與本研究結(jié)果不同，本研究結(jié)果揭示了伊犁手工奶酪中的微生物群落組成更為復(fù)雜，其原因可能是伊犁手工奶酪生產(chǎn)環(huán)境中的微生物群落較為復(fù)雜[33]且這些微生物也適于在奶酪中生存。

圖3 不同地區(qū)樣品在屬（a）和種（b）水平下細(xì)菌種類Fig. 3 Bacterial species at genus (a) and species (b) levels in samples from different regions

2.2 乳酸菌多樣性分析

2.2.1 乳酸菌形態(tài)學(xué)觀察

從MRS培養(yǎng)基中分離出68 株疑似乳酸菌，其中有20 株球菌（29.4%）、48 株桿菌（70.6%）。在MRS固體培養(yǎng)基上為乳白色或微黃色，部分透明，邊緣規(guī)則或齒狀，圓形隆起或扁平且大部分表面光滑。革蘭染色發(fā)現(xiàn)均為陽性、過氧化氫均為陰性，細(xì)胞形態(tài)為球狀或桿狀，呈單個、成對或鏈狀排列（圖4）。

圖4 不同乳酸菌的菌落形態(tài)（a）及革蘭染色后的細(xì)胞形態(tài)（b）Fig. 4 Colony morphology (a) and cell morphology (b) of different lactic acid bacterial strains

2.2.2 乳酸菌的生理生化鑒定及16S rRNA基因同源性分析

如表2所示，68 株乳酸菌均為革蘭氏陽性、過氧化氫陰性菌，能在pH 4.5、0% NaCl、4.5% NaCl和6.5% NaCl的環(huán)境中生長，能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖；都不能液化明膠、不能還原硝酸鹽、無運動性、不能在10% NaCl、無碳源的環(huán)境中生長且不能利用淀粉作為碳源。在硫化氫實驗中，只有2 株融合魏斯氏菌（Weissella confusa）能夠產(chǎn)生硫化氫，使醋酸鉛培養(yǎng)基變成黑色。短乳桿菌（Lactobacillus brevis）和大部分融合魏斯氏菌能夠發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣，其余菌株能發(fā)酵葡萄糖但不產(chǎn)氣。在糖發(fā)酵實驗中，68 株乳酸菌中有2 株瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）不能利用七葉靈、核糖，2 株短乳桿菌不能利用半乳糖、1 株融合魏斯氏菌不能利用果糖。大多數(shù)菌株都能夠發(fā)酵苦杏仁苷、纖維二糖、甘露醇、乳糖、甘露糖、水楊苷、蔗糖、蕈糖、阿拉伯糖、糊精，不能發(fā)酵蜜二糖、山梨醇、松三糖、棉籽糖、木糖等。所有乳酸菌中瑞士乳桿菌能夠利用的糖類最少，植物乳桿菌能夠利用的糖類最多，其余菌種可利用的糖類也都有所差別。

表2 68 株乳酸菌的生理生化特性Table 2 Physical and chemical properties of lactic acid bacteria isolated from cheese samples

圖5 本研究分離的乳酸菌與相近類群的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 5 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolated in this study and their related groups

將68 株乳酸菌的16S rRNA基因序列輸入到在線的EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性搜索，以序列相似性大于等于98.7%為同種標(biāo)準(zhǔn)歸類，下載相似性最高的模式菌株序列與測序序列利用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。本研究根據(jù)16S rRNA基因序列鑒定結(jié)合生理生化實驗結(jié)果，將68 株乳酸菌歸為3 屬9 種，其中T2-2等32 株菌為融合魏斯氏菌、B4-4為耐久腸球菌（Enterococcus durans）、B4-5為鳥腸球菌（Enterococcus avium）、E1-5和E3-3為瑞士乳桿菌、B1-8等8 株菌為屎腸球菌（Enterococcus faecium）、B2-10等6 株菌為短乳桿菌、E6-2等8 株菌為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、B4-6為棉籽糖腸球菌（Enterococcus raffinosus）、B4-1等9 株菌為糞腸球菌（E. faecalis）。Domingos-Lopesa等[34]從Azores地區(qū)的12 份手工“Pico”奶酪中分離出了114 株乳酸菌，其中屬于Enterococcus和Lactobacillus屬的乳酸菌種類最為豐富，這與本研究的結(jié)果較為一致，其原因可能為本研究所選擇的手工奶酪與“Pico”奶酪均為手工制作且沒有添加任何外源發(fā)酵劑。

2.2.3 不同地區(qū)可培養(yǎng)乳酸菌差異分析

表3 不同地區(qū)分離到的乳酸菌信息統(tǒng)計Table 3 Statistics of lactic acid bacteria isolated from cheeses from different areas

從表3可以看出，北屯地區(qū)分離到的乳酸菌種類最為豐富，阿勒泰及額敏地區(qū)樣品中所含有的乳酸菌種類較為貧乏。3 個地區(qū)所分離到的乳酸菌種類各不相同，其中北屯地區(qū)的樣品中含有4 種特有乳酸菌（L. brevis、E. durans、E. avium、E. raffinosus），額敏地區(qū)的樣品中含有2 種特有乳酸菌（L. plantarum、L. helveticus），而阿勒泰地區(qū)的樣品中沒有獨特的乳酸菌種，可能是奶酪原料、成熟度、制作手法以及地理位置不同所致[28]。

2.3 不同方法在乳酸菌鑒定上的比較分析

利用Illumina MiSeq測序技術(shù)及傳統(tǒng)培養(yǎng)法對14 份奶酪中鑒定出的乳酸菌進(jìn)行比較分析，可以看出兩種方法在乳酸菌的屬種鑒定上存在明顯差異（表4）。在屬水平上，Illumina MiSeq測序技術(shù)鑒定出了5 類乳酸菌，傳統(tǒng)培養(yǎng)法只分離出了3 類乳酸菌，但測序法未能鑒定出Weissella，傳統(tǒng)培養(yǎng)法未分離出Lactococcus及Streptococcus。其原因可能為本研究的測序結(jié)果只呈現(xiàn)出了相對豐度大于2%（圖1）的細(xì)菌屬，而Weissella在奶酪中的含量可能低于2%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法由于人為去重及培養(yǎng)條件等原因僅能檢測到易培養(yǎng)及優(yōu)勢菌的情況[35]，從而未能將奶酪中的乳酸菌進(jìn)行全部分離。在種水平上，傳統(tǒng)培養(yǎng)法能夠鑒定出更多的乳酸菌，高通量測序技術(shù)由于在種水平上的鑒定能力較弱[36]，故鑒定出的乳酸菌種類較少。

表4 不同方法在屬和種水平上鑒定到的乳酸菌種類Table 4 Statistics of lactic acid bacteria identified by two different methods at genus and species levels

2.4 樣品微生物基因功能預(yù)測分析

圖6 COG功能預(yù)測分析圖Fig. 6 COG function prediction

奶酪中的細(xì)菌類型可以調(diào)節(jié)奶酪在成熟過程中的風(fēng)味產(chǎn)生，并且與基因組編碼的代謝多樣性直接相關(guān)[37]。根據(jù)COG數(shù)據(jù)庫的信息，從eggNOG數(shù)據(jù)庫中解析到各個COG的描述信息及其功能信息，得到的功能預(yù)測豐度如圖6所示，14 份樣品得到的COG功能預(yù)測信息組成基本相同，但豐度差異比較明顯。奶酪中微生物一部分豐度較高的基因參與到未知功能和一般功能這兩個COG分類中，其余基因大多與氨基酸（9.35%）、碳水化合物（6.49%）和脂質(zhì)（4.57%）代謝、轉(zhuǎn)錄（8.28%）以及能量轉(zhuǎn)換（6.86%）有關(guān)，這與前人的研究結(jié)果具有相似性，表明在奶酪微生物基因組中包含大量參與蛋白質(zhì)與碳水化合物代謝有關(guān)的基因[38]，這些化合物的代謝必然伴隨著轉(zhuǎn)錄以及能量的產(chǎn)生與轉(zhuǎn)換，從而圖中也顯示出奶酪中含有較高豐度的與轉(zhuǎn)錄、能量轉(zhuǎn)換相關(guān)的基因。14 份樣品的微生物群落組成雖存在明顯差異（圖1），但每個樣品所具有的基因功能一致，只是豐度有所不同，其原因可能為不同菌群所具有的基因功能具有相似性[39-40]。

3 結(jié) 論

本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)和傳統(tǒng)培養(yǎng)相結(jié)合的方法研究了新疆伊犁14 份傳統(tǒng)手工奶酪中的乳酸菌及細(xì)菌多樣性。高通量測序結(jié)果揭示Lactobacillus spp.為奶酪中的優(yōu)勢乳酸菌屬且手工奶酪中還存在著一些植物性致病菌（如Ralstonia）和動物性致病菌（如Staphylococcus）；傳統(tǒng)培養(yǎng)法結(jié)果表明伊犁手工奶酪中的優(yōu)勢乳酸菌種為W. confusa，優(yōu)勢乳酸菌屬為Lactobacillus和Enterococcus。PICRUSt分析發(fā)現(xiàn)奶酪中菌群最主要的已知功能為氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝，即奶酪中大部分細(xì)菌與氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白及酶的生成有關(guān)，改變奶酪中的菌群結(jié)構(gòu)可能會對這些代謝過程產(chǎn)生影響，從而影響奶酪的感官品質(zhì)。高通量測序技術(shù)能將大多數(shù)微生物鑒定到“屬”的水平，無法將大多數(shù)微生物鑒定到“種”水平；而傳統(tǒng)培養(yǎng)結(jié)合生理生化及16S rRNA基因測序技術(shù)可將乳酸菌準(zhǔn)確鑒定到種，但很難對樣品中的乳酸菌進(jìn)行全面分離鑒定。因此，兩種方法的結(jié)合可以更全面地揭示奶酪中的微生物組成，為奶酪的工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時對16S rRNA序列進(jìn)行功能預(yù)測分析有利于為今后研究菌群功能奠定理論基礎(chǔ)。