鐘 嬋，謝雪瓊，孫樂(lè)常,2，張凌晶,2，劉光明,2，曹敏杰,2,*

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.水產(chǎn)品深加工技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，福建 廈門 361021）

脯氨酸內(nèi)肽酶（prolyl endopeptidase，PEP，EC 3.4.21.26）是一類能夠特異水解長(zhǎng)度小于30 個(gè)氨基酸多肽鏈脯氨酸殘基的絲氨酸蛋白酶。在人和其他哺乳動(dòng)物中，PEP參與膠原蛋白的代謝和細(xì)胞生長(zhǎng)中脯氨酸的再循環(huán)過(guò)程[1]。在水產(chǎn)動(dòng)物中，Wang Mengxiang等[2]發(fā)現(xiàn)淡水鯉魚（Cyprinus carpio）肌肉中存在與哺乳動(dòng)物酶學(xué)性質(zhì)相似的PEP，推測(cè)它可能參與魚體死后膠原蛋白的降解。此后，從草魚（Ctenopharyngodon idellus）[3]和羅非魚（Oreochromis spp.）[4]肌肉中也發(fā)現(xiàn)性質(zhì)相似的PEP。唐俊等[5]對(duì)海水魚藍(lán)圓鲹（Decapterus maruadsi）肌肉中PEP的研究發(fā)現(xiàn)，PEP可以與基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）等內(nèi)源性蛋白酶協(xié)同作用，進(jìn)一步水解由MMP分解產(chǎn)生的膠原肽的脯氨酸殘基，生成分子質(zhì)量更小的膠原肽。MMP等內(nèi)源性蛋白酶對(duì)I型和V型膠原蛋白的水解被認(rèn)為是魚體肌肉軟化的主要原因[6-8]。目前，對(duì)于魚類肌肉中的蛋白酶研究多關(guān)注于組織蛋白酶、MMP等與蛋白降解直接相關(guān)的內(nèi)源性蛋白酶[9-10]，而對(duì)于PEP及其內(nèi)源性抑制劑的研究相對(duì)較少。雖然一些人工合成的化合物[11-12]和小肽[13-14]具有PEP抑制活性，但是脯氨酸內(nèi)肽酶抑制劑（prolyl endopeptidase inhibitor，PEPI）的分離及其抑制機(jī)理鮮見(jiàn)有報(bào)道。本研究以藍(lán)圓鲹為原料分離內(nèi)源性PEPI，分析其與PEP的相互作用及抑制機(jī)理，以期為魚類PEP的作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)圓鲹購(gòu)自廈門高崎中埔水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，K值為（15.1±1.2）%，新鮮，平均體質(zhì)量300 g。

DEAE-Sepharose、Sephacryl S-200 HR、HiTrap Q HP層析樹(shù)脂 美國(guó)GE Healthcare公司；Suc-Gly-Pro-MCA熒光合成底物 日本Peptide Institute公司；電泳標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白及相關(guān)試劑 美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26.5高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；PT 2100組織搗碎機(jī) 瑞士Kinematica公司；BioPhotometer紫外分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司；FP-6200熒光分光光度計(jì) 日本Jasco公司；Chirascan圓二色譜儀 英國(guó)Applied Photophysics公司；G:Box凝膠成像儀 英國(guó)Syngene公司；WB-14恒溫水浴鍋 德國(guó)Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 PEPI的分離純化

參照Wang Mengxiang等[2]建立的方法，純化具有高活性的PEP。藍(lán)圓鲹去頭、去內(nèi)臟和去皮后，取800 g骨骼肌，加入4 倍體積的20 mmol/L三羧甲基氨基甲烷-鹽酸（Tris-HCl緩沖液，pH 8.5）進(jìn)行組織搗碎，10 000×g離心20 min后，將上清液在70 ℃水浴加熱20 min。加熱后的液體經(jīng)冰水充分冷卻后，10 000×g離心20 min，取上清液，加硫酸銨至飽和度70%后鹽析，10 000×g離心10 min后沉淀用少量的Tris-HCl緩沖液復(fù)溶透析除鹽。將透析后的樣品上樣于DEAE-Sepharose陰離子交換層析柱（2.5 cm×15 cm），用含0～0.5 mol/L氯化鈉的緩沖液進(jìn)行線性洗脫，回集對(duì)PEP有抑制效果的活性峰。樣品用3 kDa截留膜超濾濃縮后，上樣于Sephacryl S-200 HR（2.5 cm×100 cm）凝膠過(guò)濾層析柱，回集活性峰，用緩沖液透析后，上樣于HiTrapQ HP（1 mL）強(qiáng)陰離子交換層析柱進(jìn)一步分離PEPI，回集活性峰，檢測(cè)純度和抑制活力。

1.3.2 PEPI抑制活性測(cè)定

PEPI抑制活性通過(guò)抑制PEP活力表示。測(cè)定時(shí)，參照Wang Mengxiang等[2]建立的方法，在850 μL的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，將適量PEP和抑制劑樣品各50 μL充分混合。4 ℃孵育30 min后，加入50 μL的10 μmol/L的Suc-Gly-Pro-MCA熒光底物，充分混合后在37 ℃水浴反應(yīng)30 min，加入1.5 mL甲醇-異丙醇-蒸餾水（35∶30∶35，V/V）溶液終止反應(yīng)。在激發(fā)波長(zhǎng)380 nm和發(fā)射波長(zhǎng)450 nm條件下測(cè)定熒光底物釋放的7-氨基-4-甲基香豆素（7-amino-4-methylcoumarin，AMC）的熒光強(qiáng)度。以相同條件下，未添加PEPI時(shí)的PEP活力為對(duì)照組。PEPI的抑制活力單位定義為減少1 個(gè)PEP活力單位所需要的抑制劑量。PEP活力單位定義為每分鐘釋放1 nmol AMC所需要的酶量。

1.3.3 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

PEPI分離純化過(guò)程中，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)280 nm波長(zhǎng)處吸光度，進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定。其他蛋白含量采用Lowry法試劑盒測(cè)定[15]。

1.3.4 PEPI的穩(wěn)定性分析

按1.3.2節(jié)方法，以未經(jīng)處理的樣品相對(duì)抑制活力為100%，進(jìn)行穩(wěn)定性分析。

緩沖液分別為甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH 2.0～3.0）；乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 4.0～5.0）；磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液（pH 6.0～7.0）；Tris-HCl緩沖液（p H 8.0～9.0）；碳酸鈉-氫氧化鈉緩沖液（pH 10.0～11.0）；氯化鉀-氫氧化鈉緩沖液（pH 12.0）。

1.3.4.1 熱穩(wěn)定性分析

在0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中，將PEPI在不同溫度（40～100 ℃）下孵育30 min后，立即冷卻到室溫。測(cè)定經(jīng)加熱處理后的PEPI對(duì)PEP的抑制活力。

1.3.4.2 pH值穩(wěn)定性分析

將PEPI與0.1 mol/L（pH 2.0～12.0）緩沖液以1∶1（V/V）的比例混合，4 ℃孵育60 min后，取50 μL樣品，測(cè)定不同pH值緩沖液處理后PEPI的抑制活力。

1.3.5 PEPI抑制特異性分析

對(duì)PEPI抑制特異性分析選用半胱氨酸蛋白酶類的木瓜蛋白酶、外肽酶類的精氨酸氨肽酶以及絲氨酸蛋白酶類的胰蛋白酶和藍(lán)圓鲹P(yáng)EP。除木瓜蛋白酶購(gòu)于Sigma公司外，其他酶均為實(shí)驗(yàn)室制備。

以Z-Phe-Arg-MCA為底物，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）中測(cè)定木瓜蛋白酶活力；以Arg-MCA為底物，在0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中測(cè)定精氨酸氨肽酶活力；以Boc-Phe-Ser-Arg-MCA為底物，在0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）中測(cè)定胰蛋白酶活力。為減少酶活性差異對(duì)PEPI抑制效果的影響，將不同蛋白酶調(diào)至相同的酶活力后測(cè)定PEPI抑制特異性。

1.3.6 PEPI對(duì)PEP的作用類型分析

在含有不同濃度PEPI的0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.5）體系中，固定底物（Suc-Gly-Pro-MCA）濃度，測(cè)定不同PEP濃度下酶促反應(yīng)的初速率，以PEP濃度對(duì)反應(yīng)速率作圖；固定PEP濃度，測(cè)定不同底物濃度下酶促反應(yīng)的初速率，以雙倒數(shù)法作圖判斷PEPI的抑制作用機(jī)理和類型。

1.3.7 PEPI對(duì)PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

利用圓二色譜儀對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，將蛋白濃度相同的PEPI和PEP各100 μL混合后置于0.05 cm石英樣品池中分析。掃描條件：波長(zhǎng)范圍185～260 nm，掃描時(shí)間0.6 s/nm，溫度25 ℃。以5 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）為空白組，PEP為對(duì)照組。利用CDNN軟件計(jì)算樣品的二級(jí)結(jié)構(gòu)含量。

1.3.8 PEPI對(duì)PEP熱變性的影響

利用圓二色譜測(cè)定PEPI存在下PEP熱變性溫度的改變。掃描條件：波長(zhǎng)范圍185～260 nm，溫度范圍20～60 ℃，升溫速度0.5 ℃/min，其他條件與1.3.7節(jié)相同。利用Global 3軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PEPI的分離純化

藍(lán)圓鲹骨骼肌粗蛋白液樣品經(jīng)過(guò)70 ℃熱處理及硫酸銨鹽析后，上樣于DEAE-Sepharose弱陰離子交換層析柱。由圖1A可知，目的蛋白有效地吸附于該層析柱，且與未吸附部分的大量雜蛋白有效分離。目標(biāo)蛋白在0.05～0.1 mol/L氯化鈉濃度下被洗脫。將DEAESepharose吸附部分的活性峰濃縮后上樣于Sephacryl S-200 HR（圖1B），目標(biāo)蛋白與大分子質(zhì)量雜蛋白分離?；丶钚苑迳蠘佑贖iTrapQ HP強(qiáng)陰離子層析柱（圖1C），用濃度為0～0.5 mol/L的氯化鈉鹽緩沖液洗脫，目的蛋白在濃度0.06～0.12 mol/L氯化鈉下被洗脫?；丶钚苑褰?jīng)Tricine-十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分析，結(jié)果顯示，純化得到藍(lán)園鲹P(yáng)EPI的分子質(zhì)量約為10 kDa蛋白條帶（圖2），與魚類肌肉中其他絲氨酸蛋白酶抑制劑有明顯的差異。例如，魚類肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶抑制劑的分子質(zhì)量分別為：白姑魚（Argyrosomus argentatus）55 kDa[16]，鯽魚（Carassius auratus）120 kDa[17]，藍(lán)圓鲹（D. maruadsi）56 kDa[18]。藍(lán)園鲹P(yáng)EPI的分子質(zhì)量約為10 kDa，與從樹(shù)蛙Phyllomedusa sauvagii皮分離的分子質(zhì)量為6.6 kDa的PEPI[19]相似，均屬于低分子質(zhì)量蛋白酶抑制劑。

由表1可知，從800 g藍(lán)圓鲹肌肉中可純化得到0.5 mg PEPI，得率約為0.6 %，純化倍數(shù)為43.7。

圖1 藍(lán)圓鲹P(yáng)EPI純化柱層析圖譜Fig. 1 Chromatographic purification of PEPI

圖2 藍(lán)圓鲹P(yáng)EPI的Tricine-SDS-PAGE圖譜Fig. 2 Tricine-SDS-PAGE of PEPI

表1 藍(lán)圓鲹P(yáng)EPI的純化效果Table 1 Summary of purification of PEPI

2.2 溫度和pH值對(duì)PEPI活力的影響

圖3 溫度（A）及pH值（B）對(duì)PEPI穩(wěn)定性的影響Fig. 3 Thermal (A) and pH (B) stability of PEPI

如圖3所示，藍(lán)圓鲹肌肉內(nèi)源性PEPI具有較好的熱穩(wěn)定性和pH值耐受性。在40～90 ℃溫度下孵育30 min后，PEPI的抑制活力基本一致，90 ℃時(shí)還具有90%的相對(duì)抑制活性（圖3A）；在中性偏堿的環(huán)境（pH 6.0～12.0）下，其抑制活性基本相同，pH 2.0時(shí)，其相對(duì)抑制活性仍然有70%左右（圖3B），顯示所獲PEPI是一種對(duì)熱和pH值穩(wěn)定性強(qiáng)的抑制劑。

2.3 PEPI的抑制特異性

圖4 PEPI對(duì)不同蛋白酶活力的影響Fig. 4 Effect of PEPI on the activity of different proteinases

為進(jìn)一步明確PEPI的抑制特異性，將PEPI與不同類型的蛋白酶孵育，分析抑制效果。如圖4所示，PEPI對(duì)絲氨酸蛋白酶的PEP表現(xiàn)明顯抑制作用，抑制關(guān)系呈現(xiàn)典型的濃度依賴性，當(dāng)濃度增加至0.8 μmol/L，PEP的剩余活力低于10%。而PEPI對(duì)其他類型的絲氨酸蛋白酶并未表現(xiàn)出抑制效果，即便當(dāng)PEPI濃度增加至0.8 μmol/L時(shí)，胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶活性仍未出現(xiàn)下降。此外，PEPI對(duì)半胱氨酸蛋白酶類的木瓜蛋白酶和外肽酶類的氨肽酶也未有明顯的抑制。與魚類肌原纖維結(jié)合型絲氨酸蛋白酶的內(nèi)源性抑制劑類似[16-18]，內(nèi)源性PEPI是蛋白類抑制劑，其特異性抑制效果與合成化合物類絲氨酸蛋白酶抑制劑的抑制特性是不同的。以上結(jié)果說(shuō)明本研究純化的抑制劑屬于PEP的內(nèi)源性專一抑制劑，對(duì)PEP的生理活性調(diào)控起重要作用因此，今后有必要通過(guò)蛋白分析或分子克隆技術(shù)獲得PEPI的結(jié)構(gòu)信息，為研究其與PEP的作用機(jī)理提供可靠的依據(jù)。

2.4 PEPI對(duì)PEP的抑制類型

固定Suc-Gly-Pro-MCA熒光底物濃度，在不同濃度PEPI（0.1、0.2、0.3 μmol/L）作用下，以PEP濃度S對(duì)酶促反應(yīng)初速率V作圖。如圖5A所示，是一組通過(guò)原點(diǎn)的直線，且直線斜率隨著PEPI濃度的增大而降低，說(shuō)明PEPI對(duì)PEP的抑制作用是可逆的。

固定PEP濃度，改變底物Suc-Gly-Pro-MCA的濃度，以底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)初速率雙倒數(shù)作圖。如圖5B所示，米氏常數(shù)Km值隨著PEPI濃度的增大而減小，而酶的最大反應(yīng)速率Vmax值則維持不變（a、b），說(shuō)明PEPI可能在結(jié)構(gòu)上與PEP的底物相似，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的方式結(jié)合到PEP活性中心，阻止其與底物結(jié)合進(jìn)而抑制酶促反應(yīng)。由雙倒數(shù)作圖可知，藍(lán)圓鲹肌肉中內(nèi)源性PEPI的抑制常數(shù)Ki為0.34 μmol/L（圖5B內(nèi)置圖）。

圖5 PEPI對(duì)PEP的抑制作用（A）及抑制常數(shù)分析（B）Fig. 5 Inhibitory mechanism (A) and inhibition constant (B) of PEPI on PEP

2.5 PEPI對(duì)PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于維持酶的穩(wěn)定性和活性至關(guān)重要，特別是活性中心區(qū)域的構(gòu)象[20-23]。如表2所示，天然狀態(tài)下藍(lán)圓鲹P(yáng)EP的二級(jí)結(jié)構(gòu)由α-螺旋（26.23%）、β-折疊（28.43%）、β-轉(zhuǎn)角（18.60%）和無(wú)規(guī)卷曲（31.57%）組成，該結(jié)果與豬PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)有一定差異，后者由α-螺旋（22%）、β-折疊（29%）。轉(zhuǎn)角（22%）和無(wú)規(guī)卷曲（26%）組成[24]。推測(cè)這是由于這兩種動(dòng)物在分類上差異大，PEP的同源性不高（73%）導(dǎo)致的。PEP屬于典型的α/β-折疊酶，其中α/β-折疊結(jié)構(gòu)由8 個(gè)β-折疊通過(guò)5 個(gè)α-螺旋連接組成，為酶活性位點(diǎn)提供一個(gè)穩(wěn)定的支架[25]。當(dāng)PEP中α-螺旋和β-折疊含量發(fā)生變化時(shí)，酶活性中心的構(gòu)象發(fā)生變化，酶促反應(yīng)被抑制[26]。

表2 PEPI對(duì)PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Table 2 Secondary structure contents of PEP in the absence and presence of PEPI

如表2所示，PEPI存在時(shí)，PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋含量增加了3.70%（從26.23%增至27.20%），無(wú)規(guī)卷曲增加了6.11%（從31.57%增至33.50%），而β-折疊含量下降了9.71%（從28.43%降至25.67%），（α+β）結(jié)構(gòu)總含量下降了3.27%（從54.66%降至52.87%），PEP活性下降90.68%（從100%降至9.32%），表明PEP活性的下降可能與其二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變有關(guān)。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化與已報(bào)道競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑對(duì)其他α/β-折疊酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)影響相似。研究表明，當(dāng)非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑與α-葡萄糖苷酶結(jié)合時(shí)，α-螺旋含量顯著降低，β-折疊含量基本穩(wěn)定，而β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量呈上升趨勢(shì)；但當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑與其結(jié)合時(shí)，α-螺旋含量增加，β-折疊含量下降，且兩者的總量呈下降的趨勢(shì)，β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲的含量呈上升趨勢(shì)[27]。因此，PEP-PEPI復(fù)合物形成后，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)的方式發(fā)生α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)增加和β-折疊結(jié)構(gòu)降低的二級(jí)結(jié)構(gòu)改變，影響PEP活性位點(diǎn)的構(gòu)象進(jìn)而抑制酶促反應(yīng)，該結(jié)果也與圖5競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型的結(jié)果相吻合。

2.6 PEPI對(duì)PEP熱變性的影響

蛋白質(zhì)溶液在逐漸加熱到臨界溫度以上時(shí)，其構(gòu)象從天然狀態(tài)到變性狀態(tài)有一個(gè)顯著的轉(zhuǎn)變，這個(gè)轉(zhuǎn)變的中心溫度稱為熔化溫度（Tm）[28]。當(dāng)抑制劑存在時(shí)，酶-抑制劑復(fù)合物會(huì)提高酶的Tm值，Tm改變?cè)酱蟊砻鲀烧唛g的親合力越大。因此，Tm的改變常用來(lái)評(píng)價(jià)抑制劑和酶的結(jié)合能力[29-30]。

圖6 PEPI對(duì)PEP熱變性的影響Fig. 6 Tm values of PEP in the absence and presence of PEPI

如圖6所示，天然狀態(tài)下PEP的Tm約為39.0 ℃，PEPI存在時(shí)，Tm增加至43.5 ℃，PEP-PEPI復(fù)合物的形成顯著提高了PEP的Tm值。這是由于PEP-PEPI復(fù)合物形成后，需要更多的能量解離復(fù)合物[29-30]。另一方面，在蛋白質(zhì)中，α-螺旋結(jié)構(gòu)對(duì)于穩(wěn)定空間結(jié)構(gòu)至關(guān)重要[20]。如表2所示，PEPI存在時(shí)PEP二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)增加，可能是其Tm值增加的另一個(gè)原因。PEPI存在時(shí)，PEP熱變性的改變表明，PEP-PEPI復(fù)合物有利于PEP蛋白質(zhì)在熱轉(zhuǎn)變過(guò)程中穩(wěn)定它的構(gòu)象。

3 結(jié) 論

從藍(lán)圓鲹骨骼肌中分離純化出一種分子質(zhì)量約為10 kDa的內(nèi)源性PEPI，為絲氨酸蛋白酶類PEP的專一性抑制劑。抑制動(dòng)力學(xué)和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，PEPI是可逆競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，其抑制常數(shù)Ki為0.34 μmol/L。其抑制機(jī)理為PEPI存在時(shí)，PEP的α-螺旋和無(wú)規(guī)卷曲組分增加，β-折疊組分降低，影響活性位點(diǎn)的構(gòu)象，進(jìn)而抑制PEP促反應(yīng)。PEP-PEPI復(fù)合物的形成不僅改變PEP的二級(jí)結(jié)構(gòu)，而且提高PEP在熱轉(zhuǎn)變過(guò)程中的熔化溫度（Tm）。