陳小藝，陳俊，楊之帆

(1.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；2.武漢科技大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430081)

0 引言

本實(shí)驗(yàn)采用白芨無菌苗為材料，以白芨假鱗莖芽為外植體，通過研究不同外源添加物、接種密度、活性炭濃度、切割手法、切割手法與密度等，對白芨假鱗莖芽無菌苗增殖的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)行研究. 以期為建立白芨試管苗高效穩(wěn)定的快繁體系，為白芨的工廠化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料由湖北大學(xué)陳永勤實(shí)驗(yàn)室提供的白芨無菌瓶苗(切取假鱗莖).

1.2 不同外源添加物對白芨假鱗莖增殖的影響試驗(yàn)以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7.0 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加香蕉泥、土豆汁、番茄汁，調(diào) pH5.8，培養(yǎng)4周后通過觀察其生長情況并記錄數(shù)據(jù)算出其增殖系數(shù)a. 為探究不同外源物質(zhì)對白芨假鱗莖芽增殖的影響，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素見表1.

1.3 接種密度對白芨假鱗莖增殖的影響試驗(yàn)以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，調(diào)pH5.8，分別以密度為4個(gè)、6個(gè)、8個(gè)，接種后4周統(tǒng)計(jì)結(jié)果計(jì)算出增殖系數(shù)從而探究密度對白芨芽增殖系數(shù)的影響.每一處理接種6瓶作為重復(fù).

1.4 活性炭濃度對白芨假鱗莖增殖的影響試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L，添加活性炭，添加量為：3.75 g/L、6.25 g/L、8.75 g/L、11.25 g/L，調(diào)pH5.8，以不添加活性炭為對照，接種后每周統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)算出增殖系數(shù)a. 試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平見表2.

表1 外源添加物對白芨假鱗莖增殖影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表2 活性炭濃度對白芨假鱗莖增殖的影響試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.5 切割手法對白芨假鱗莖增殖的影響試驗(yàn)以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，無菌條件下取出瓶苗，切取假鱗莖，再將切取的假鱗莖分別以從中間縱切一刀、縱切兩刀、橫切一刀、 橫切一刀不切斷、兩對角切取來處理，4周后觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)算出增殖系數(shù)a，比較切割手法對白芨假鱗莖增殖效果的影響.每一處理接種6瓶作為重復(fù).

1.6 切割手法與密度對白芨假鱗莖增殖的影響試驗(yàn)以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，無菌條件下取出瓶苗，切取假鱗莖，假鱗莖均以密度為4分別按上述手法進(jìn)行接種，每周后觀察結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)算出增殖系數(shù)a，比較切割手法與密度組合對白芨假鱗莖增殖效果的影響.

2 結(jié)果與分析

2.1 外源天然物質(zhì)對白芨增殖系數(shù)的影響以不添加外源天然物質(zhì)的培養(yǎng)基作為對照組，研究不同外源物質(zhì)對白芨增殖效果的影響.白芨無菌假鱗莖接入培養(yǎng)基后每周觀察結(jié)果，如圖1、表3所示為接種90 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

圖1 不同情況下白芨假鱗莖芽無菌苗增殖情況

表3 白芨無菌增值系數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表3可見：白芨假鱗莖在香蕉養(yǎng)基中芽的增殖系數(shù)為3，最大，所以白芨最佳外源添加物為香蕉.

2.2 接種密度對白芨增殖系數(shù)的影響不同接種密度，會影響培養(yǎng)基中白芨代謝產(chǎn)物的含量，因此可能會對白芨增殖產(chǎn)生一定的影響，如表4所示為接種90 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

表4 白芨無菌苗增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表4可見，接種密度為4或6的時(shí)候增殖系數(shù)分別為3.294，3.238，但是在接種密度為6時(shí)白芨的生長情況最好，所以最適接種密度為6.

2.3 活性炭對白芨增殖系數(shù)的影響活性炭具有吸附，在蘭科植物組培中使用較多，而不同濃度的活性炭也會對白芨增殖產(chǎn)生影響，如表5所示為接種75 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

表5 白芨無菌苗增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表5可見，白芨在活性炭濃度為3 g/L時(shí)，增殖系數(shù)為4.107最高，且生長情況最佳，所以白芨假鱗莖增殖培養(yǎng)基中活性炭濃度最適為3 g/L.

2.4 切割手法對白芨增殖系數(shù)的影響切割手法可能會影響白芨的增殖，接種密度為2時(shí)，以不同切割手法對白芨假鱗莖進(jìn)行處理，如表6所示為接種45 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

表6 白芨無菌苗增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表4可見，當(dāng)交叉相切時(shí)，增殖系數(shù)為3.167最高，所以最佳的切割手法為交叉相切.

2.5 切割手法與接種密度對白芨增殖系數(shù)的影響切割手法與接種密度相互作用可能會對白芨增殖有更大的作用，如表7所示為接種30 d后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

表7 白芨無菌苗增殖系數(shù)統(tǒng)計(jì)

由表6和表7可見，白芨假鱗莖在接種密度為4，切割手法為中間橫劃一刀時(shí)增殖系數(shù)最高，所以白芨假鱗莖增殖時(shí)，切割手法為中間橫劃一刀，接種密度為4時(shí)為最佳.

3 小結(jié)與討論

外源物質(zhì)對白芨假鱗莖芽的增殖有較大影響.選擇合適的外源物質(zhì)及其濃度可以顯著增加白芨假鱗莖的增殖系數(shù). 香蕉泥、馬鈴薯提取液是蘭科植物組培中常用的添加物，富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，可以促進(jìn)植物細(xì)胞的增殖與生長[16]. 在本研究中，通過不同外源物在MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+瓊脂7.0 g/L基礎(chǔ)培養(yǎng)基中對白芨假鱗莖的增殖系數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)比較，結(jié)果表明，在添加適量香蕉泥的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中白芨假鱗莖的增殖系數(shù)為3，數(shù)值最大. 所以在番茄汁、香蕉泥、馬鈴薯提取液這3種外源物質(zhì)中，適宜量的香蕉泥是白芨最佳外源添加物.

此外，接種密度對白及假鱗莖芽的增殖也有一定影響.接種密度為4、6、8三個(gè)水平時(shí).接種密度為4和6的增殖系數(shù)相當(dāng)，但在接種密度為6時(shí)白芨的生長情況最好，所以白芨的最適接種密度為6. 在同一個(gè)接種瓶中，如果接種過密會增加接種時(shí)間、提高污染率，并可能導(dǎo)致培養(yǎng)基營養(yǎng)供應(yīng)不足，最后增殖系數(shù)也不高. 如果接種過于稀疏，又會增加接種瓶數(shù)，也可能會造成培養(yǎng)基營養(yǎng)利用率不高. 因而選擇合適的接種密度，對提高增殖系數(shù)、培養(yǎng)基利用率至關(guān)重要.

活性炭濃度對白芨假鱗莖的增殖也有影響. 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加不同濃度的活性炭，以不添加活性炭為對照.通過實(shí)驗(yàn)可得在活性炭濃度為3 g/L時(shí)，增殖系數(shù)最高，且生長情況最佳. 活性炭有吸附作用，可以有效防止白芨假鱗莖芽增殖過程中的褐化，以及毒素的累積、培養(yǎng)基中可能出現(xiàn)的高鹽毒害等不利因素，活性炭還能吸附瓊脂中所含的雜質(zhì)以及蔗糖在高壓下消毒產(chǎn)生的 5-羥甲基糠醛[17]. 但活性炭濃度有一個(gè)最適宜濃度，本研究，通過實(shí)驗(yàn)手段比較分析出活性炭的最適宜濃度.

最后本實(shí)驗(yàn)還探究了切割手法與接種密度對白芨假鱗莖芽增殖系數(shù)的影響，通過實(shí)驗(yàn)可得白芨假鱗莖在接種密度為4，切割手法為中間橫劃一刀時(shí)增殖系數(shù)最高. 切割手法和接種密度在植物組織培養(yǎng)中常常被人們忽略，但有時(shí)只是一個(gè)不同的手法和簡單的處理，可能會使實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)生很大改變，因而本實(shí)驗(yàn)意在從這些細(xì)微的方面來探究其影響結(jié)果，有著重要的意義.

白芨種子細(xì)小，自然條件下需要與共生菌共生才能萌發(fā)[15]，傳統(tǒng)的分生繁殖難以在短時(shí)間內(nèi)得到性狀穩(wěn)定、整齊的優(yōu)質(zhì)種苗[19]，快速繁殖技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)白芨種苗是緩解白芨資源緊缺的有效方式之一[20].白芨快速繁殖和工廠化生產(chǎn)提供了技術(shù)支持.