王睿龍，牛曉曉，金珊

(湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062)

0 引言

人類原發(fā)型家族性腦鈣化(primary familial brain calcification，PFBC)是一種罕見的常染色體遺傳疾病.其定義為至少兩個大腦豆狀核受到鈣化的影響.鈣化還可能會出現在小腦、尾狀核、腦白質、皮質溝、丘腦及齒狀核等地方[1].PFBC的臨床癥狀有許多，最常見的為精神病、運動障礙(movement disorders，MD)及認知障礙等.目前發(fā)現有四個相關的致病基因，分別為SLC20A2、PDGFRB、PDGFB和XPR1.XPR1是唯一已知的人類磷酸鹽輸出蛋白[2-3].XPR1一個由696個氨基酸構成的多重跨膜蛋白，此蛋白為小鼠異嗜性小鼠白血病病毒受體.果蠅作為一種科學研究中常用的模式生物，其基因背景已經被研究清楚，使得運用果蠅在模擬人類遺傳疾病方面更加方便與高效.據了解在果蠅中XPR1對應的同源基因為CG10483(dXPR1)，同源性高達55%.因此我們擬以果蠅為模型探究XPR1基因的功能.本實驗室曾構建過3株XPR1的移碼突變的果蠅，但突變果蠅在實驗中表型相反，沒有說服力與可參考性.因此，我們擬用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，設計兩個sgRNA在dXPR1基因兩端切割，構建出dXPR1大片段缺失的果蠅即dXPR1-，以確定XPR1基因的功能及對神經系統(tǒng)發(fā)育的影響.

CRISPR/Cas9系統(tǒng)最初是人們在細菌防御系統(tǒng)中發(fā)現的.其中短回文重復序列間隔的有規(guī)律聚合(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)基因于1987年在大腸桿菌中首次發(fā)現.21世紀初，在原核生物中發(fā)現CRISPR相關蛋白(CRISPR-associated (Cas) proteins)[4-7].如今CRISPR/CAS9系統(tǒng)作為定向靶序列基因編輯技術廣泛應用于生物各個領域.起初在該系統(tǒng)中，外源DNA與crRNA(CRISPR RNA)有20個配對的堿基對引導Cas9核酸內切酶識別靶向序列，再與tracer RNA(trans-acting crRNA)結合引導Cas9核酸內切酶進行切割[8-10].現在，人們將過程簡化，把crRNA和tracrRNA轉變?yōu)樵O計一條sgRNA(single guide RNA)引導Cas9酶切割.在設計sgRNA時sgRNA的5’端的20個堿基為引導序列，需要注意的是在其3’端要有一個PAM(protospacer adjacent motif)序列，Cas9酶可以識別PAM序列并在此序列上游第三個堿基的5’端切割.我們通常用的PAM序列為NGG，NAG或GAA也有研究證明可作為PAM序列[11-13].在Cas9內切酶切割后會產生DSB(double strand break)，之后生物體會產生兩種DSB修復方式：NHEJ(nonhomologous end joining)和HDR(homology-directed)[14-15].生物體利用NHEJ修復方式可得到移碼突變與氨基酸缺失的品系，而利用HDR修復方式，同時提供供體序列(Donor)可用來構建點突變果蠅，插入特定基因果蠅等轉基因品系果蠅.

本實驗室利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，擬構建完全或大片段缺失的dXPR1-的果蠅品系.果蠅研究者Gratz等通過顯微注射，得到了表達Cas9酶的質粒的果蠅[16-17].在前人研究的基礎上我們要構建大片段缺失的果蠅品系，只需在距離dXPR1基因前600堿基序列與距離基因末端500堿基序列中分別設計兩條sgRNA，將設計并構建好的sgRNA表達載體質粒注射入表達Cas9酶的質粒的果蠅卵中，引導Cas9內切酶切割便可以得到dXPR1基因大片段缺失的果蠅品系dXPR1-.

1 材料與方法

1.1 果蠅品系表達Cas9內切酶于果蠅生殖腺的果蠅品系BL54591(nos-Cas9)和常用balancer果蠅MKRS/TM6B.

1.2 載體在本實驗中我們使用的sgRNA表達載體為pCDF-3.此質粒來自Addgene公司，環(huán)狀，大小6 284 bp，帶有BbsⅠ酶切位點.

1.3 抗體見表1.

表1 本研究所用抗體

1.4 實驗方法

1.4.1 sgRNA的設計 本實驗預計在dXPR1基因的前600堿基與距離基因末端500堿基各設計一對sgRNA，兩對sgRNA的距離盡可能遠，使目的基因缺失的片段更多，sgRNA序列的設計在CRISPR optimal target finder(http://tools.flycrispr.molbio.wisc.edu/targetFinder/)上設計完成，之后在設計好的sgRNA5’端加上BbsⅠ酶切位點，再交由生物公司合成兩對帶有BbsⅠ酶切位點的單鏈sgRNA.

1.4.2 sgRNA表達載體的構建 用BbsⅠ內切酶切割pCDF3質粒，膠回收得到有BbsⅠ粘性末端的線性pCDF3.將合成的兩對sgRNA復性得到有BbsⅠ粘性末端的短片段雙鏈DNA，將之與切過的pCDF3酶聯(lián)，轉化接入大腸桿菌中進行擴大培養(yǎng).最后篩選得到連入有sgRNA的pCDF3質粒，并質粒中提得到高濃度sgRNA表達載體.

1.4.3 顯微注射 進行顯微注射，方法參考Yu等[18].將兩對 sgRNA表達載體混勻稀釋到注射濃度，將其注射入nos-Cas9果蠅的胚胎中(胚胎發(fā)育時間不要超過1 h).將注射得到的成蟲與MKRS/TM6B進行單只雜交，然后PCR鑒定子代果蠅，將鑒定有轉基因果蠅的果蠅培育管中的所有子代果蠅再次與MKRS/TM6B進行單只雜交，再次鑒定得到dXPR1-突變體果蠅(見圖一).

圖1 顯微注射流程

1.4.4 免疫印跡 取等量dXPR1-突變體與野生型成蟲頭，分別加入RIPA裂解液和一定量蛋白酶抑制劑放置于冰上進行研磨，離心取上清，測蛋白濃度，配上樣液.在37 ℃水浴鍋中水浴30 min，然后上樣跑電泳，轉膜(將蛋白膜轉移到PVDF膜上)，接著用PBST配5% 的脫脂奶粉進行封閉1 h，染一抗(Anti-CG10483)室溫搖30 min在4 ℃過夜，洗一抗1 h每15 min用PBST洗一次，染二抗常溫2 h，洗二抗1 h，最后曝光.

2 結果

2.1 sgRNA表達載體的構建本實驗設計了兩條sgRNA以確保造成dXPR1基因的大片段缺失，第一條sgRNA在dXPR1基因上匹配序列為從579位堿基到598位堿基，第二條sgRNA序列從3180位堿基到3199位堿基.將兩條sgRNA分別插入pCDF3表達載體中，測序(見圖2).

圖2 sgRNA的設計及表達載體的構建

2.2 獲得dXPR1-突變體果蠅將中提得到的兩對高濃度sgRNA表達載體稀釋到一定量后混勻注射入nos-Cas9果蠅的卵中，注射產生的后代與MKRS/TM6B果蠅單只雜交產生F1代果蠅，dXPR1基因全長為3 412 bp.在dXPR1基因前后兩端設計檢測引物PCR鑒定F1代果蠅，發(fā)現對照組只有一條3 000 多bp大小的條帶，而F1代果蠅中PCR檢測發(fā)現有條帶為500 bp左右，符合預期，經測序確實為dXPR1基因的大片段缺失，其缺失片段從573位堿基到3201位堿基.再將F1代突變體果蠅管中的其他雄果蠅與MKRS/TM6B果蠅進行單只雜交，再進行第二次PCR篩選得到可遺傳的dXPR1-突變體果蠅品系(見圖3).

圖3 dXPR1-突變體的篩選與檢測

圖4 蛋白表達檢測tublin條帶為內參，從左至右依次為野生型，純合dXPR1-的蛋白檢測.

2.3 穩(wěn)定遺傳的dXPR1-突變體果蠅品系的鑒定得到的純合dXPR1-突變體果蠅需要通過Western blot檢測蛋白的表達水平，蛋白表達顯示結果與預期一致，WT對照組，純合dXPR1-突變體都能染出tublin的條帶，但是野生型還能染出dXPR1的條帶而純合dXPR1-突變體沒有染出對應條帶，因此確定得到了穩(wěn)定遺傳的純合dXPR1-突變體果蠅(見圖4).

3 討論

本實驗構建大片段缺失突變體dXPR1-所利用的基因編輯技術為CRISPR/Cas9系統(tǒng).其近年來被廣泛應用于生物學的各個領域中.本實驗注射了600個卵，在100只成活幼蟲中有53只成蟲存活，單只雜交后PCR檢測，有一管單雜后代有突變體產生，但相較于之前的P因子插入等基因編輯技術，用CRISPR/Cas9系統(tǒng)大大降低了實驗工作量與實驗時間，同時能更精確編輯得到想要的轉基因果蠅.這些技術的出現與成熟為我們的生物學實驗提供了巨大幫助，但在生物學中還有更多的新技術與方法需要我們去研究發(fā)現.

PFBC病征通常表現為精神病征，運動障礙，認知障礙等.XPR1是PFBC的致病基因之一，且是唯一的磷酸鹽輸出蛋白.因此XPR1在神經系統(tǒng)中起到重要作用.目前在果蠅中與XPR1相關的基因，最新報道的有4個，分別為CG10483，CG7536，CG10481，CG2901.其中CG7536，CG10481主要在腸道干細胞中表達，CG2901則在毛原細胞中有表型，而CG10483(dXPR1)主要在大腦中表達，對腦神經有影響.通過對比表達范圍與PFBC病征的臨床表現，我們認為CG10483基因與XPR1基因具有高度一致性.我們已經成功構建了dXPR1-果蠅品系，可以利用dXPR1-果蠅進行各項表型檢測.目前初步的觀察發(fā)現純合的dXPR1-突變體并不致死，但發(fā)育成成蟲的時間有些許延長.由于XPR1控制了磷酸鹽的輸出，我們可以嘗試檢測dXPR1-突變體果蠅大腦中的磷離子含量的變化.同時考慮到XPR1對神經系統(tǒng)發(fā)育與對鈣離子調控的影響，后續(xù)我們也將探究突變體果蠅腦袋大小的變化，在果蠅大腦中能否觀察到鈣沉淀現象，同時我們將嘗試用GCamp這個功能原件來檢測果蠅大腦中的鈣離子濃度.