李雨含 王祎

(1. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院；2. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

肝癌是嚴(yán)重危害人類生命和健康的常見惡性腫瘤之一，揭示其發(fā)病機(jī)制，探尋潛在藥物靶點(diǎn)是當(dāng)今腫瘤治療的主要研究策略[1]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)作為一個轉(zhuǎn)錄因子，主要調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞存活、血管生成以及免疫反應(yīng)等過程。當(dāng)STAT3被上游酪氨酸激酶磷酸化后，可形成二聚體，進(jìn)而轉(zhuǎn)位入核與其調(diào)控的靶基因位點(diǎn)的DNA結(jié)合，引起靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯[2]。目前發(fā)現(xiàn)，STAT3的靶基因大多與促增殖、抗凋亡、血管生成、轉(zhuǎn)移、免疫逃避等腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的生物學(xué)行為密切相關(guān)[3]。在正常細(xì)胞，STAT3具有短暫活化而后迅速失活的特性，然而研究者發(fā)現(xiàn)在70%的人類實(shí)體腫瘤中，STAT3處于持續(xù)高活性狀態(tài)[4]。因此，STAT3是一個極具前景的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)。

啤酒花(HumuluslypulusLinn.)是眾所周知的釀酒原料，并作為民間藥物被長期使用。黃腐酚(Xanthohumol，XN)是啤酒花中分離得到一種異戊烯類黃酮化合物。近年來黃腐酚的藥用價值受到廣泛的關(guān)注，研究證實(shí)黃腐酚具有較強(qiáng)的抗炎和抗腫瘤活性，并能增強(qiáng)放化療導(dǎo)致的乳腺癌細(xì)胞凋亡[5, 6]。此外，還有報道稱黃腐酚可通抑制多重耐藥基因(Multidrug resistance 1，MDR1)和表皮生長因子受體(Epithelial growth factor receptor，EGFR)等信號通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[6]。然而對黃腐酚對肝癌細(xì)胞的殺傷作用及其具體的分子機(jī)制尚未見文獻(xiàn)報道。

本研究采用人類肝癌細(xì)胞系BEL-7402及SMMC-7721為研究模型，揭示黃腐酚在抗肝癌治療中的潛在價值和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞

黃腐酚(Xanthohumol，XN)，購自成都普思生物有限公司，以DMSO溶解，配制成100 mM的母液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ烁伟┘?xì)胞株BEL-7402及SMMC-7721，購自上海吉凱生物有限公司，置于含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，在含5%CO2的37℃環(huán)境中培養(yǎng)。4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)購自Sigma-Aldrich。CCK8試劑盒及ECL化學(xué)發(fā)光底物，購自碧云天。磷酸化及非磷酸化的STAT3、cyclin D1、Bcl2、GAPDH等抗體，由Signal Antibody提供。HRP-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG，購自Proteintech。PVDF膜，購自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞活力檢測

BEL-7402和SMMC-7721肝癌細(xì)胞，按照5000個/孔的密度接種于96孔板中。孵育過夜后，加入不同濃度的黃腐酚(0-40 μM)繼續(xù)分別處理24 h和48 h[7]。隨后，每孔加入10 μL的CCK8試劑，37℃孵育2 h，450 nm處檢測吸光度值。

1.2.2細(xì)胞核染色

BEL-7402細(xì)胞以黃腐酚處理24 h后，隨后以4%多聚甲醛固定15 min,加入DAPI(0.5 μg·mL-1)置于暗處染色5min。最后于倒置熒光顯微鏡(IX53，Olympus)下觀察細(xì)胞核染色情況。當(dāng)細(xì)胞核出現(xiàn)熒光強(qiáng)度升高，染色質(zhì)固縮，細(xì)胞核破碎等情況時，則可視為細(xì)胞凋亡。隨機(jī)選取3個視野，計算凋亡細(xì)胞比率。

1.2.3Western blotting

BEL-7402細(xì)胞以黃腐酚處理24 h后，棄去培養(yǎng)基，以PBS洗2次。隨后，加入含有1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解15 min。收集細(xì)胞裂解液后，12000 g，4 ℃離心5 min，取上清液，加入5×Loading buffer，100 ℃煮沸10 min。接著，將等量的樣品上樣至SDS-PAGE膠，經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，以5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h。隨后，加入不同的一抗(1：1000)，4 ℃孵育過夜。隨后，回收一抗，以TBST洗3次后，加入二抗(1：5000)室溫孵育1 h。最后，以TBST洗3次后，ECL進(jìn)行曝光顯影。采用Quantity One軟件對條帶進(jìn)行定量分析。

1.2.4統(tǒng)計分析

所有的統(tǒng)計分析均以Graphpad Prism 5.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時視為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 黃腐酚對肝癌細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，黃腐酚(2～40 μM)分別處理肝癌細(xì)胞株BEL-7402及SMMC-7721 2 h-48 h后，細(xì)胞活力受到明顯影響，其抑制效率最高可達(dá)80%(P<0.01)，并呈現(xiàn)劑量依賴性。

圖1 CCK8法檢測黃腐酚對肝癌細(xì)胞增殖的影響注：BEL-7402(A)和SMMC-7721(B)細(xì)胞增殖情況。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.2 黃腐酚對肝癌細(xì)胞凋亡的影響

與溶劑對照組相比，黃腐酚(20 μM和40 μM)處理組的細(xì)胞核出現(xiàn)熒光強(qiáng)度升高，染色質(zhì)固縮(箭頭所示)和細(xì)胞核破碎(三角形所示)。計數(shù)分析結(jié)果表明，20 μM和40 μM黃腐酚處理24 h可致40%和70%的BEL-7402細(xì)胞凋亡，見圖2。

圖2 黃腐酚對肝癌細(xì)胞凋亡的影響注：(A)典型的細(xì)胞凋亡圖片，標(biāo)尺=40 μm。(B)凋亡細(xì)胞比(%)。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.3 免疫印跡檢測黃腐酚對肝癌細(xì)胞中STAT3活化的影響

與溶媒對照組相比，黃腐酚(5～20 μM)能明顯抑制肝癌細(xì)胞中STAT3的磷酸化(P<0.01)，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。半定量分析結(jié)果表明，10 μM和20 μM黃腐酚處理24 h，對STAT3磷酸化的抑制率約為35%和55%。然而，黃腐酚對STAT3的表達(dá)沒有明顯影響，見圖3。

圖3 黃腐酚對肝癌細(xì)胞中STAT3活化的影響注：(A)典型的Western blotting電泳圖；(B)半定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

2.4 免疫印跡檢測黃腐酚對肝癌細(xì)胞中STAT3靶基因表達(dá)的影響

如圖4所示，與溶媒對照組比較，黃腐酚(5～20 μM)能劑量依賴性地抑制BEL-7402細(xì)胞中STAT3靶基因Bcl-2和cyclin D1的表達(dá)。半定量結(jié)果顯示，在20 μM黃腐酚處理的肝癌細(xì)胞中，Bcl-2和cyclin D1的表達(dá)下調(diào)達(dá)到了70%和50%(P<0.0001)。

圖4 黃腐酚對肝癌細(xì)胞中STAT3靶基因表達(dá)的影響注：(A)典型的Western blotting電泳圖；(B)半定量分析。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，n=3。與溶媒對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

3 討論

STAT3是包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤發(fā)生發(fā)展以及耐藥性闡釋的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，因此通過靶向STAT3為肝癌的治療提供了潛在的可能性。前期，Dokduang等人發(fā)現(xiàn)黃腐酚能抑制膽管癌細(xì)胞中由白介素6(IL-6)誘導(dǎo)的STAT3活化[8]。然而，黃腐酚對肝癌等癌細(xì)胞中組成型活化的STAT3的影響并未涉及。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，黃腐酚能有效抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞中STAT3的組成性活化。同時，黃腐酚也能有效STAT3的靶基因，從而發(fā)揮抑制肝細(xì)胞癌細(xì)胞生長的作用。我們的結(jié)果表明，黃腐酚具有預(yù)防和治療肝癌的潛在價值。

除了能夠調(diào)節(jié)與增殖凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄翻譯外，STAT3還能上調(diào)一系列與免疫抑制相關(guān)基因的表達(dá)，如環(huán)氧化酶2(Cyclooxygenase2，COX2)和程序性死亡配體1(Programmed cell death protein 1 ligand 1，PD-L1)等[9, 10]。同時，有研究表明，黃腐酚能夠有效抑制巨噬細(xì)胞中由脂多糖誘導(dǎo)的COX2表達(dá)[11]。因此，黃腐酚有可能通過抑制STAT3進(jìn)而抑制了免疫抑制基因COX2等的表達(dá)，從而增強(qiáng)了抗腫瘤免疫反應(yīng)。黃腐酚這一作用在肝癌的免疫治療領(lǐng)域具有較強(qiáng)的潛在應(yīng)用價值。

綜上所述，黃腐酚通過抑制STAT3的組成型活化，從而發(fā)揮抗肝癌的作用。然而，對于其抑制STAT3活化的具體機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。