馬紅梅 王璐璐 段雙全

摘 要：目的：探究西藏工布烏頭和露蕊烏頭2種藥用植物植株莖內(nèi)內(nèi)生菌。方法：采用培養(yǎng)基培養(yǎng)法和載玻片法對分離得到的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析，并利用分子生物學(xué)技術(shù)提取菌株DNA進(jìn)行測定。結(jié)果：從2種西藏烏頭屬藥用植物中獲得的2株菌株，均屬于半知菌亞門曲霉屬環(huán)繞亞屬黑色組的真菌。

關(guān)鍵詞：西藏;藥用植物;內(nèi)生菌;DNA;烏頭屬

Abstract：Objective：This paper mainly explores the Isolation and identification of endophyte? in medicinal plant of Aconitum in Tibet. Methods：The strains of endophyte were isolated and analyzed morphologically by medium culture method and slide method. DNA of each strain was extracted by molecular biology technology for determination. Results：The two strains obtained belonged to the black fungus group of Aspergillus，Monilia-ceous，Hyphomycetales，Hyphomycetes，Deuteromycotina.

Key words：Tibet;Medicinal plants;Endophytes;DNA;Aconitum

內(nèi)生菌（Endophyte）一詞最早是由德國科學(xué)家de Bary首先提出的，早期定義是指生活在植物組織內(nèi)的微生物。在長期的研究過程中，由于不同科研工作者研究的植物、角度、目的及得到的結(jié)論不盡相同，因此“內(nèi)生菌”的概念和解釋被多次修改。截至目前，普遍被認(rèn)可的“內(nèi)生菌”的概念是指生活史中某一時期生活在植物體內(nèi)而其本身對植物組織不會引起明顯病害癥狀的微生物類群。一般認(rèn)為，植物內(nèi)生菌與宿主互惠共生、協(xié)同進(jìn)化。

近年來，隨著生態(tài)學(xué)及醫(yī)學(xué)研究的不斷深入，國內(nèi)外專家學(xué)者及相關(guān)的科研工作者對植物內(nèi)生菌的研究越來越多。大量研究表明：植物內(nèi)生菌在植物生命過程中起著十分重要的作用，主要體現(xiàn)在對植物的生長發(fā)育、次生代謝、應(yīng)對生物脅迫等方面具有重要的作用[1]。目前，關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究已經(jīng)滲透到醫(yī)學(xué)、中藥學(xué)、生態(tài)學(xué)、微生物學(xué)、植物病理學(xué)等多個學(xué)科領(lǐng)域。自Vogl于1898年成功從黑麥草（Lolium tu-melentum）的種子中分離得到第1株內(nèi)生真菌以來[2]，已有很多研究者從不同植物中分離得到了不同種類的植物內(nèi)生菌。眾多的研究成果不僅豐富了內(nèi)生菌種類，更加深了人們對內(nèi)生菌的認(rèn)識。目前，關(guān)于植物內(nèi)生菌的研究和報道較多的是從不同植物內(nèi)生菌內(nèi)發(fā)現(xiàn)一些具有天然活性的代謝產(chǎn)物，主要包括萜類、黃酮類、內(nèi)酯類、酚類、多肽類等[3，4]?？梢?，植物內(nèi)生菌作為一種重要的微生物資源，是新型天然活性物質(zhì)的重要來源之一。

西藏植物資源豐富，尤其是藥用植物，其中烏頭屬植物在我國作為藥材的應(yīng)用已有很長的歷史。據(jù)文獻(xiàn)記載，烏頭屬植物的主要化學(xué)成分是烏頭堿，并含有多糖、香豆素、黃酮、甾體等化學(xué)成分，具有調(diào)節(jié)免疫、麻醉止痛、抗炎和抗腫瘤等多重功效[5]。西藏現(xiàn)有烏頭屬植物73種，占全國烏頭屬植物總種數(shù)（含變種）的20.50%;該屬資源的豐富度在全國范圍內(nèi)僅次于四川和云南，其中較明確的藥用種類有13種，占西藏烏頭屬植物總種數(shù)的17.81%[6]。西藏烏頭屬植物主要分布在海拔2000～5000m的高山草甸、山坡石隙、礫石草坡和灌木叢林等地[7]。

目前，關(guān)于烏頭屬藏藥研究較多的是在其化學(xué)成分及其結(jié)構(gòu)以及生理活性等方面，尚未見對其內(nèi)生菌的相關(guān)研究報道。植物內(nèi)生菌按其種類一般分為內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌及內(nèi)生放線菌3類。為探明西藏烏頭屬植物體內(nèi)內(nèi)生菌的存在及分類，本試驗對西藏2種常見的烏頭屬植物工布烏頭和露蕊烏頭莖內(nèi)內(nèi)生菌進(jìn)行了分離與鑒定，以期為今后該屬植物資源的保護(hù)及烏頭屬藏藥的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗樣品 工布烏頭和露蕊烏頭屬于毛茛目、毛茛科（Crassulaceae）、烏頭屬（Rhodio-la L.）的植物[8]。工布烏頭和露蕊烏頭植株，均采自西藏林芝市工布江達(dá)縣米拉山東坡，海拔4410m（北緯29°53′6″、東經(jīng)92°20′19″）。

1.1.2 培養(yǎng)基及制備方法 采用PDA培養(yǎng)基（葡萄糖10g、土豆200g、瓊脂15g、蒸餾水），定容到1000mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理 取工布烏頭和露蕊烏頭的莖用自來水反復(fù)沖洗后，再用醫(yī)用消毒水沖洗數(shù)遍，放入無菌操作臺內(nèi)滅菌30min。然后將植物的莖切成3～4cm的小段，再縱向切開放入盛有次氯酸鈉溶液的燒杯中15min，之后分別用硫代硫酸鈉、乙醇和無菌水進(jìn)行沖洗[9]，置于PDA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 菌株的形態(tài)觀察 將分離得到的菌株移至新的培養(yǎng)基中進(jìn)行分離純化，再將純化后的菌株以點(diǎn)接方式，接種到新的PDA培養(yǎng)基中。待觀察到培養(yǎng)基表面有菌絲生長時，用已滅菌的醫(yī)用手術(shù)刀把培養(yǎng)基切成長和寬為2cm×2cm，之后移到已經(jīng)滅菌的載玻片上，蓋上蓋玻片繼續(xù)培養(yǎng)[10]，設(shè)置智能溫控培養(yǎng)箱的溫度為25℃，濕度為60%～80%的范圍內(nèi)，每2d觀察1次孢子的發(fā)育情況。

1.3 純化后菌株的分子生物學(xué)研究

1.3.1 菌株DNA的提取 挑取真菌菌絲添加到PBS緩沖液中，加入100U的Lyticase（sigma L4025），于37℃條件下破壁處理30min。之后用真菌基因組DNA快速提取試劑盒（此試劑盒由寶信生物有限公司提供，貨號DN1112）提取基因組DNA，用于后續(xù)的基因擴(kuò)增。

1.3.2 rRNA基因ITS區(qū)間片段的擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系（50μL）如表所示。

1.3.3 rRNA基因ITS區(qū)間片段序列的測定 人工配制1.2%的瓊脂糖DNA膠，用凝膠電泳鑒定得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，使條帶涌動，直至流動到適當(dāng)位置時，找到在凝膠成像中的目的條帶，將目的條帶進(jìn)行回收。DNA序列測序用的是回收到的目的條帶。

1.3.4 rRNA基因ITS區(qū)間片段的系統(tǒng)發(fā)育分析 將北京博邁德基因公司所測得的ITS序列通過互聯(lián)網(wǎng)提交到Genbank數(shù)據(jù)庫，運(yùn)用BLAST進(jìn)行網(wǎng)上在線比對，得到相似較高的序列，并將其作為參考序列進(jìn)行序列號登記，運(yùn)用Clustal_X2.0軟件進(jìn)行比對。利用生物進(jìn)化數(shù)據(jù)分析方法以及進(jìn)化樹軟件對進(jìn)化距離進(jìn)行計算并建立系統(tǒng)發(fā)育的進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株形態(tài) 在25℃溫度條件下，工布烏頭和露蕊烏頭莖內(nèi)均可分離得到黑色絨毛狀菌株，能在14d后在PDA培養(yǎng)基上迅速生長繁殖，經(jīng)多次分離純化菌株，發(fā)現(xiàn)菌株菌落呈現(xiàn)黑色，其整體菌落形態(tài)較為疏松，且有較淡的霉味，經(jīng)分析之所以散發(fā)出較淡的霉味，出現(xiàn)黑色粉末，是因為菌落表面有部分已經(jīng)分化產(chǎn)生孢子，其分生孢子頭部為黑色，頂囊的形狀為球形或近球形，直徑為30～45μm;分生孢梗莖光滑無色，近頂囊處略帶有暗褐色;產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)為雙層，并呈現(xiàn)出褐色;平梗是（8～10）μm×L2.5～3μm，壁的粗糙程度很明顯，且具有不規(guī)則的脊?fàn)钔蛊鸹蚩v向條紋。

2.2 菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹 將工布烏頭和露蕊烏頭莖內(nèi)提取得到的菌株的rRNA基因ITS區(qū)間序列提交到GenBank，得到登錄號分別為GB6961294和GB6961295。通過用BLAST在線對序列做相似性分析。對于無法用人工判定的高覆蓋率和高相似度比對結(jié)果，運(yùn)用MEGA6.0和Clustal_X2.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得到菌株的聚類分析情況（見圖3）。從圖3可以看出，工布烏頭和露蕊烏頭內(nèi)生菌菌株均歸類于曲霉屬環(huán)繞亞屬（D）中的黑色組（C），2種烏頭的內(nèi)生菌菌株與黑曲霉親緣關(guān)系最為接近。

3 討論

本研究中，通過對采自西藏林芝市工布江達(dá)縣米拉山東坡的工布烏頭和露蕊烏頭2種藥用植物植株莖內(nèi)內(nèi)生菌的進(jìn)行分離，得到菌株。通過查閱中國真菌志（第五卷）中相關(guān)內(nèi)容得知，該菌株歸屬到曲霉屬黑色組真菌的一種。然而，在菌株瓶梗和?；螒B(tài)上的描述與模式物種有所差異。另外，通過查閱真菌超微形態(tài)[11]、中國菌物和普通真菌學(xué)等文獻(xiàn)，都將其列入曲霉屬真菌;通過rRNA基因ITS間隔區(qū)序列進(jìn)行發(fā)育分析，進(jìn)一步確立了菌株在系統(tǒng)發(fā)育上的進(jìn)化位置，屬于曲霉屬環(huán)繞亞屬黑色組的一種真菌。本試驗結(jié)果對于補(bǔ)充西藏烏頭屬藥用植物內(nèi)生菌的相關(guān)研究以及對藏藥植物資源的保護(hù)和利用具有一定的意義。

植物內(nèi)生菌是一個巨大的微生物新資源，具有重要的醫(yī)藥應(yīng)用潛力。西藏植物資源豐富，尤其是藥用植物資源豐富，生境特殊。因此，對西藏這種特殊生境下更多的藥用植物內(nèi)生菌的研究，包括其他的烏頭屬藏藥植物內(nèi)生菌的分離鑒定，可以為西藏新型藏藥的開發(fā)利用提供一定的參考。

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（責(zé)編：張宏民）