王婷 ，于灝 ，魏侃 ，王寧

（1.沈陽醫(yī)學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽醫(yī)學院附屬中心醫(yī)院 手外科，遼寧 沈陽 110024；3.手外科研究所；4.骨科）

周圍神經(jīng)損傷后感覺和運動功能遭到破壞，容易造成傷殘，嚴重降低患者的生活質量，大大增加了人們的經(jīng)濟負擔[1-3]。所以尋求治療策略必不可少。雪旺細胞(SC)在神經(jīng)傳導中和軸突再生過程中是必不可少的，在外周神經(jīng)損傷后，會導致神經(jīng)脫髓鞘以及軸突再生受損，可能造成周圍神經(jīng)病變和神經(jīng)病理性疼痛[4]。它在Wallerian 變性中經(jīng)歷去分化、脫髓鞘、增殖遷移等一系列過程[5]，形成的Bungner 帶具有引導近端軸突再生的功能[6]。因此，在研究中發(fā)現(xiàn)雪旺細胞遷移能力增加即可認為是神經(jīng)修復過程良好的表現(xiàn)。

在先前的體外實驗中，我們已經(jīng)了解到添加外源性PLGF 可提高雪旺細胞遷移能力，其中ERK1/2信號通路可能是介導SCs 遷移的重要因素，而AKT信號通路可能是促進SCs 運動的另一種途徑[7]。MEK-ERK 是一種與細胞遷移相關的細胞通路[8]，抑制該通路一般用于抑制腫瘤細胞凋亡保護機制，是一種較受歡迎的抗腫瘤治療策略[9]。它還與細胞周期調控及增殖有關，在免疫系統(tǒng)中MEK/ERK 在適宜抗原刺激下還可以激活增強細胞周期進展和增殖，但過度刺激會誘導細胞周期阻滯[10]。AKT 在細胞生長和存活過程中起著關鍵作用[11]。在外源性神經(jīng)保護藥物作用下，神經(jīng)元樣細胞的核及核周區(qū)域以及少突膠質細胞和星形膠質細胞可發(fā)現(xiàn)高表達的磷酸化AKT[12]。同時有研究發(fā)現(xiàn)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中抑制MEK/ERK 和PI3K/AKT 通路可以導致少突膠質細胞的遷移顯著降低[13]，表明ERK 和AKT 的確有可能對雪旺細胞的遷移產(chǎn)生影響，因此本實驗通過體內實驗將ERK 以及AKT 抑制劑直接作用于神經(jīng)，進一步證實ERK 及AKT 調節(jié)雪旺細胞遷移的能力。

1 材料與方法

1.1 動物模型建立

SD 大鼠30 只作為實驗對象，體重180～220 g，由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。所有程序均按照動物倫理審查委員會批準的協(xié)議進行。0.2%氯胺酮和0.2%地西泮混合溶液，予2.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉，按照無菌原則暴露坐骨神經(jīng)，以坐骨大孔處即閉孔內肌近端1.0 cm 平面為壓斷界面，使用恒力裝置施加10 N 的力進行壓迫，以壓迫后復夾神經(jīng)損傷處鼠呈無反應狀態(tài)為宜。按說明配置工作液U0126（9903，Cell Signaling） 及 LY294002（9901，Cell Signaling）。此前實驗證實其最適合濃度分別為30μM 和10μM[7]。規(guī)定大鼠右肢為實驗組，左肢為對照組。對照組均僅作壓傷處理，實驗組在壓傷處理后使用微量注射器（HAMILT）分別注入飽和量工作液。

1.2 樣本取材

分別于術后 12 h、24 h、3 d、7 d、14 d 各時間點隨機取出3 只大鼠，以空氣栓塞的方法處死，切取雙側神經(jīng)解合口兩端至少0.5 cm 長的坐骨神經(jīng)，于-80℃冷凍保存。

1.3 免疫組化化學染色

經(jīng)脫蠟水化、0.01 M 的PBS 清洗后，正常兔血清封閉30 min 后傾掉，加入p-75 NGF Receptor 重組抗體（EP1039Y，Abcam，美國），在 4℃環(huán)境下孵育過夜。第 2 天經(jīng) 0.01M 的 PBS 清洗，滴加兔 IgG（SA1022，博士德，中國），室溫封閉30 min 后再以經(jīng)0.01 M 的PBS 清洗。加入新鮮DAB 工作液濕盒封閉，于鏡下監(jiān)測到合適顯色后水洗，再入蘇木素復染后水洗，最后入酸乙醇分化后水洗，脫水封片。

1.4 組織學評價

應用Image Pro Plus 6.0 分析上述切片p-75 NFR 免疫組化陽性程度及Bungner 帶數(shù)量。以平均光密度值[Density(mean)]表達免疫組化陽性程度；以3～5 個連成一線的細胞核作為Bungner 帶來計數(shù)。每張切片均于高倍視野下（×200）隨機取3 個視野進行分析計算。

1.5 統(tǒng)計學方法

1.6 Western blot 測定蛋白

1.6.1 細胞樣本全蛋白提取

將組織盡量剪碎，在每1.0 mL 冷Lysis Buffer中加入10μL 磷酸酶抑制劑、1μL 蛋白酶抑制劑和5μL 100 mM PMSF，混勻，冰上保存數(shù)分鐘待用。組織塊轉至新的預冷的離心管中，加入上述配制好的冷Lysis Buffer。置于4℃搖床平臺上，溫和振蕩15 min，14 000 rpm/min，4℃離心 15 min，取上清為全蛋白提取物。

1.6.2 蛋白定量（Bradford 法）

根據(jù)凱基Braford 蛋白含量檢測試劑盒說明書繪制標準曲線，取待測蛋白樣品適量，加入考馬斯亮蘭 G250 染液 990 mL，混勻，測定 595 nm OD 值，然后在標準曲線上求所得濃度。

1.6.3 SDS-PAGE 電泳

成層膠聚合后，小心拔去樣品梳子，然后加入lxTris-Gly 的電泳緩沖液。吸取適量樣品上清加入樣品孔中，在樣品旁的孔中加入預染的蛋白Marker，未添加樣品上清的孔中，加入l×SDS 上樣緩沖液保持膠面平衡。電壓開始設置為60 V，當?shù)鞍讟悠愤M入分離膠后，電壓可提高到 90 V。參照預染Marke 的位置，待目的條帶進入凝膠最佳分離區(qū)(大約凝膠的2/3)時，停止電泳。預先將轉膜液4℃預冷。托盤上打開轉移盒，靠近陰極側的內面鋪上己經(jīng)用轉膜緩沖液浸濕的有孔維墊，其上放3 層浸有轉膜緩沖液的Whatman3 MM 濾紙，注意排凈氣泡。小心撬開玻璃板，將膠放置含有轉膜液的托盤內，將含有目的條帶的分離膠切下，用轉膜液浸泡后置于濾紙上。在凝膠上鋪上經(jīng)甲醇和轉膜液浸濕的NC 膜，膠和膜之間不能存有氣泡，膜、濾紙和凝膠的大小大致相同。在NC 膜上再放兩層浸過轉膜液的Whatman 濾紙，注意排凈氣泡。放上第二塊海綿墊，使整個轉印夾層依次形成“纖維墊-濾紙-凝膠-NC 膜-濾紙-纖維墊”層次，關閉轉印夾，放入轉移槽中，槽中灌滿轉膜液。打開電源，穩(wěn)流200 mA，120 min。轉膜結束后，取出NC 膜并作好標記，用TBST 洗膜10 min×3 次。

圖1 Bungner 帶形成情況

圖1f 為術后 12 h、1 d、3 d、7 d、15 d 時 p-75 NGFR 半定量表達，可見3d 時p-75 NGFR 的表達達到峰值

圖2 對照組p-ERK1/2 及p-AKT 的表達及Bungner帶的變化情況

圖3 U0126 干預下p-ERK1/2及 p -AKT 的 表 達 及Bungner 帶的變化情況

圖4 U0126+LY294002 干預下 p-ERK1/2 及 p-AKT 的表達及Bungner 帶的變化情況

1.6.4 封閉、抗原抗體反應

封閉：將NC 膜放入平皿中，加入含5%脫脂奶粉的封閉液，搖床振蕩1.5～2 h。封閉結束后，用TBST洗膜10 min×3 次。將膜放入含一抗 (ERK (4695，Cell Signaling,USA),p-ERK(4370,Cell Signaling,USA),AKT(4691,Cell Signaling,USA),p-AKT(4060,Cell Signaling,USA) 的平皿中，4℃搖床振蕩孵育過夜。第2 天取出，室溫振蕩30 min，吸棄一抗，TBST洗10 min×3 次。用5%脫脂奶粉封閉液稀釋二抗，室溫搖床振蕩反應1～2 h。二抗反應結束后，回收二抗。然后用 TBsT 洗膜 5～10 min×3 次。將 EcL 化學發(fā)光試劑盒中的A、B 兩種液體按l∶l 等體積混合，配置成工作液備用。將NC 膜從TBsT 中取出，甩掉多余的液體，將含有蛋白質的膜正面朝上，滴加適量工作液，用保鮮膜覆蓋。使用G:BOX chemiXR5 成像。使用Gel-Pro32 軟件對結果進行灰度分析。

2 結果

2.1 華勒氏變性遠端神經(jīng)p-75 NGFR 表達

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后遠端各時間點的p-75 NGFR 的表達均呈陽性；隨著時間推移而p-75 NGFR表達逐漸增加（圖1a-e），至3 d 時表達達到峰值（圖1f）。

2.2 Bungner 帶的形成

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，遠端在損傷后1 d 觀察到Bungner 帶并未廣泛形成，有多處3～5 個細胞核成行排列，Bungner 帶尚處在形成過程中（圖1b）。遠端神經(jīng)在損傷3 d 后各時間點p-75 NGFR 陽性染色的激活態(tài)雪旺細胞高度增值，細胞核呈條帶狀排列形成 Bungner 帶（圖 1c-e）。

2.3 Bungner 帶形成與ERK1/2 及AKT 信號相關

隨著華勒氏變性時間推移，Bunger 帶形成數(shù)量增加并伴隨著p-ERK1/2 表達明顯增加，p-AKT 無明顯改變（圖2）；在神經(jīng)損傷遠端注射MEK 抑制劑U0126（30μM），結果 Bungner 帶形成數(shù)量趨勢無明顯改變（圖3）。在神經(jīng)損傷遠端注射MEK 抑制劑U0126 及 LY294002(10μM)，結果 Bungner 帶形成數(shù)量明顯減少（圖4）。

3 討論

大鼠坐骨神經(jīng)損傷后，神經(jīng)遠端發(fā)生華勒氏變性，雪旺細胞由靜息態(tài)被激活，特異性表達p-75 NGFR 經(jīng)歷去分化、增值，并遷移形成Bungner 帶從而引導軸突再生。本研究中華勒氏變性神經(jīng)遠端各時間點的p-75 NGFR 表達均呈陽性，客觀反映了華勒氏變性雪旺細胞被激活后p-75 NGFR 的持續(xù)表達狀態(tài)。在此過程中由起初的激活態(tài)雪旺細胞3～5 成行，3 d 后各時間點形成Bungner 帶形成由少至多，這與Vargas 等報道結果相符[14]。

神經(jīng)損傷華勒氏變性中，Bungner 帶形成數(shù)量與p-ERK 表達呈正相關，p-AKT 表達未見明顯改變。但當在神經(jīng)損傷遠端單獨注射MEK 抑制劑U 0126時，結果顯示Bungner 帶數(shù)量未見明顯減少。而同時應用U 0126 及LY 294002 后Bungner 帶形成數(shù)量在各時間點明顯減少，說明ERK 信號途徑及PI3K 途徑可能與雪旺細胞遷移相關，并同時參與Bungner 帶形成，其中具體機制有待我們進一步研究。另外，我們觀察到p-ERK 及p-AKT 在抑制劑注射3 d 后逐漸開始表達，這可能與抑制劑在動物體內有效作用時段或有效作用劑量相關。