劉國輝魏長征侯春林*
硬腦膜是腦組織表面重要的組織結(jié)構(gòu),由內(nèi)外兩層組成,是保護腦組織及儲存腦脊液的重要屏障。在神經(jīng)(脊柱)外科中,保持硬腦膜的完整對于顱腦(脊柱)手術(shù)患者意義重大。腫瘤、外傷及手術(shù)本身等均可造成硬腦膜的缺損[1]。修復(fù)硬腦膜缺損對減少顱內(nèi)感染、腦脊液漏和腦組織的瘢痕形成至關(guān)重要[2]。目前,臨床上應(yīng)用的硬腦膜的替代材料很多,但沒有一種材料能夠達到理想的硬腦膜缺損修復(fù)要求而沒有相應(yīng)的并發(fā)癥,所以對于硬腦膜替代材料的探索也一直在進行。劉雙利及周霖等[3-4]實驗研究均驗證了羥丁基幾丁糖凝膠即時封堵腦脊液漏的巨大潛力。本實驗的目的是探索羥丁基幾丁糖膜修補硬腦膜缺損遠期的效果及可行性。
羥丁基幾丁糖為幾丁糖的衍生物,具有良好的生物相容性,制備成膜具有高韌性、多孔結(jié)構(gòu)、可在生理緩沖溶液中保存等特點。力學性能測試顯示該膜在干燥狀態(tài)下呈現(xiàn)出一種極高的拉伸強度,浸潤的濕態(tài)下呈現(xiàn)出一種較好的拉伸韌性,其拉伸長度可到達自身長度的4倍左右,可用于硬腦膜缺損的修復(fù)。
1.1.1 羥丁基幾丁糖膜的制備
在選定的模具底部及周邊區(qū)域,用一定濃度的明膠溶液進行涂膜,低溫或室溫條件下放置待凝,向模具中注入一定體積的溫敏性幾丁糖溶液(注入前溫敏性幾丁糖溶液應(yīng)在冰箱中保存或預(yù)冷),室溫或40℃左右烘箱中靜置待凝,將該水凝膠連同模具一同放入預(yù)先加熱好的PBS水浴中進行脫膠。將凝膠轉(zhuǎn)移至新鮮的PBS溶液中密封,水浴放置24h,使凝膠充分進行相轉(zhuǎn)變。第二天,取膜,去離子水漂洗30 min,放入特定模具中,鋪平,進行冷凍干燥。將凍干后的海綿裁剪后用PBS浸潤,放入裝有PBS的西林瓶中,密封后121℃高壓滅菌 15 min,即得[5]。天義福(DuraMax)人工硬腦膜(簡稱生物膜):牛肌腱Ⅰ型膠原。成分為牛肌腱Ⅰ型膠原,牛肌腱Ⅰ型膠原由膠原纖維構(gòu)成,膠原纖維相互纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[6]。
1.1.2 羥丁基幾丁糖膜的結(jié)構(gòu)
大體觀察羥丁基幾丁糖膜為半透明膠體狀膜(見圖1),質(zhì)地柔軟,其拉伸韌性較強,掃描電鏡下觀察羥丁基幾丁糖膜橫切面(見圖2)及縱切面(見圖3)均為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),故由此可知羥丁基幾丁糖膜立體結(jié)構(gòu)為蜂窩狀。
圖1 羥丁基幾丁糖膜大體觀察
圖2 羥丁基幾丁糖膜橫切面結(jié)構(gòu)(SEM)
圖3 羥丁基幾丁糖膜縱切面結(jié)構(gòu)(SEM)
取普通健康成年新西蘭兔15只(由海軍醫(yī)學研究所動物房提供),雌雄不限。所有實驗動物的飼養(yǎng)及實驗環(huán)境均達到實驗動物標準,實驗過程的處置符合人道主義的標準,并符合本院倫理委員會的相關(guān)要求。
兔耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉(1.2~1.5 mL/kg)靜脈麻醉,術(shù)前使用磺芐西林鈉靜脈注射預(yù)防感染,麻醉成功后頭頂剃毛、固定,常規(guī)消毒頭部皮膚,取顱中線正中切口長約5 cm,切開頭皮、骨膜,暴露顱骨,顱中線兩側(cè)對稱造成兩1.2 cm×1.2 cm顱骨缺損,暴露硬腦膜,兩側(cè)各對稱造成0.8 cm×0.8 cm硬腦膜缺損,左側(cè)使用羥丁基幾丁糖膜覆蓋硬腦膜缺損(實驗組),右側(cè)使用生物膜覆蓋缺損(對照組),依次縫合切口,術(shù)后觀察動物飲食、活動及傷口情況,術(shù)后1周拆線。
術(shù)后30、90、180 d對動物進行取材,各個時間點空氣注射法處死5只動物,沿原切口切開,顯露雙側(cè)原硬腦膜缺損處,觀察植入材料與周圍組織情況,新生組織與腦組織粘連情況,取手術(shù)區(qū)域組織固定于10%福爾馬林溶液中,石蠟包埋HE染色。
術(shù)后30、90、180 d,各時間點實驗組、對照組及未手術(shù)區(qū)域正常硬腦膜每個標本取1張HE染色切片,200倍鏡下各取3個視野,行成纖維細胞計數(shù),取均值。
采用 SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示,組間比較采用獨立樣本 檢驗;檢驗水準 =0.05,<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
實驗動物術(shù)后狀態(tài)良好,正常進食,未見肢體癱瘓、大小便失禁等神經(jīng)癥狀,術(shù)后傷口愈合良好,未見感染,術(shù)后7 d拆線。
術(shù)后30d:雙側(cè)手術(shù)區(qū)域均未見明顯炎癥反應(yīng),見對照組生物膜被周圍組織包繞,與周圍界限不清,可見大部分被吸收,生物膜及周圍新生組織覆蓋腦組織,與腦組織未見明顯粘連;實驗組羥丁基幾丁糖膜與周圍組織無明顯粘連,膜顏色變成淡黃色,膜容易取出,膜下可見新生膜覆蓋腦組織,新生膜與腦組織無粘連。
術(shù)后90 d(見圖4)及180 d對照組生物膜結(jié)構(gòu)消失,已被完全吸收,對照組生物膜周圍增生組織覆蓋腦組織,與腦組織粘連,腦組織表面血管清晰可見,未見腦組織表面瘢痕形成,腦組織顏色未見明顯異常;實驗組羥丁基幾丁糖膜與周圍組織無明顯粘連,膜顏色變成棕黃色,膜容易取出,未見膜被吸收跡象,膜下可見新生膜覆蓋腦組織,實驗組新生膜半透明,與腦組織無明顯粘連,腦組織表面血管清晰可見,腦組織表面未見瘢痕形成,腦組織顏色未見明顯異常。術(shù)后90 d及180 d,雙側(cè)手術(shù)區(qū)域均未見慢性炎癥反應(yīng)。
術(shù)后30d羥丁基幾丁糖膜下新生膜:鏡下可見大量成纖維細胞,成纖維細胞周圍大量膠原纖維。術(shù)后30 d生物膜及其周圍組織:鏡下可見成纖維細胞增殖,成纖維細胞密度較羥丁基幾丁糖側(cè)低,可見大量脂肪細胞,細胞排列紊亂。
術(shù)后90d羥丁基幾丁糖膜下新生膜:新生膜中成纖維細胞明顯減少,可見大量膠原纖維,膠原纖維排列整齊,與正常兔硬腦膜相似性高(見圖5)。術(shù)后90 d生物膜及其周圍組織:成纖細胞數(shù)較前減少,仍可見大量脂肪細胞。
術(shù)后180 d羥丁基幾丁糖膜下新生膜中成纖維細胞進一步減少,膠原纖維排列整齊,與正常兔硬腦膜相似性高。術(shù)后180 d人工硬腦膜下新生膜:成纖維細胞少,可見大量脂肪細胞,與正常兔硬腦膜相似性低(見圖6)。
圖4 術(shù)后90 d大體觀察,a為對照組新生硬腦膜,b為實驗組新生硬腦膜,c為未被吸收的羥丁基幾丁糖膜
圖5 正常兔硬腦膜HE染色(×200)
圖 6 術(shù)后 30、90、180 d新生膜 HE 染色(×200)
術(shù)后 30 d實驗組與對照組成纖維細胞計數(shù)分別為(355.66±10.09)、(259.96±14.29)個/視野,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(=10.724,<0.001);術(shù)后180d實驗組與正常兔硬腦膜成纖維細胞計數(shù)分別為(171.98±20.29)、(180.62±11.90)個/視野,兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.72,=0.492)。術(shù)后 180 d對照組成纖維細胞計數(shù)為(118.00±18.57)個/視野,與正常兔硬腦膜比較,差異有統(tǒng)
表1 實驗組和對照組新生膜中成纖維細胞計數(shù)
硬腦膜是覆蓋在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表面的腦膜的最外層,它是由膠原纖維、成纖維細胞以及平行排列的彈力纖維組成的結(jié)締組織[7]。硬腦膜可能因外傷或者腫瘤的切除而受損[8],硬腦膜缺損可導致腦脊液漏、顱內(nèi)積氣、頭痛、惡心、嘔吐、硬膜下出血、假性腦脊膜膨出、腦膜炎等并發(fā)癥。因此,修復(fù)硬腦膜缺損十分重要。
目前,用于硬腦膜缺損治療或者研究探索的材料主要分為5類:自體組織;同種異體組織;動物來源天然組織;動物組織衍生;人工合成材料 [9]。盡管自體組織移植避免了免疫排斥的問題[10],但是它們存在防水性能欠佳、疤痕組織的形成,以及移植材料的取材有限等問題,只能用于小的硬腦膜缺損,不適應(yīng)于大的硬腦膜缺損或者多個小的硬腦膜缺損[11]。同種異體材料、生物復(fù)合材料存在動物病原體的傳播、低機械強度以及免疫反應(yīng)等問題[12]。人工合成材料不會傳染疾病,不會導致粘連,且可以很容易地加工成所需的形狀和尺寸,而且原材料相對充足,價格相對便宜[13]。人工合成材料用于硬腦膜修復(fù)具有廣泛的前景。理想的硬腦膜修復(fù)替代材料應(yīng)具有以下特點:生物安全性良好,無排斥反應(yīng);能夠防止腦脊液漏;不與腦組織粘連;遠期有新生膜形成;遠期能夠吸收;材料容易獲取,來源廣泛[14-17]。
羥丁基殼聚糖是一種無細胞毒性、無急性溶血、無全身急性毒性反應(yīng)、組織相容性良好的生物材料[18]。羥丁基幾丁糖膜由羥丁基幾丁糖采用明膠相變涂層的方式脫膜而制成,其力學性能較羥丁基殼聚糖凝膠有很大改善,其力學性能可達到理想硬腦膜替代材料的要求,同時該材料具有幾丁糖類似的防粘連性能[19-20]。
本研究首先研究了人工硬腦膜和羥丁基幾丁糖膜的微觀結(jié)構(gòu),人工硬腦膜具有由膠原纖維相互不規(guī)則纏繞形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),羥丁基幾丁糖膜具有蜂窩狀的立體結(jié)構(gòu),兩種結(jié)構(gòu)都具有較多的孔隙作為細胞生長的支架。同時觀察了羥丁基幾丁糖膜作為硬腦膜修補材料的遠期效果,實驗結(jié)果表明,羥丁基幾丁糖膜下有新生膜形成,新生膜與膜下腦組織未見粘連,羥丁基幾丁糖膜與周圍組織無粘連,容易取出。HE染色結(jié)果顯示術(shù)后30d時新生膜中可見大量成纖維細胞,成纖維細胞計數(shù)與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義。成纖維細胞(fibroblast,F(xiàn)B)是主要的修復(fù)細胞,是創(chuàng)傷修復(fù)的工程師、建筑者和管理員[21],Schick等[22]實驗表明參與硬腦膜修復(fù)的主要是成纖維細胞。對硬腦膜創(chuàng)面加入成纖維細胞生長因子,硬腦膜創(chuàng)面愈合加速;早期成纖維細胞大量增殖有利于硬腦膜的修復(fù);術(shù)后30 d,實驗組HE染色觀察成纖維細胞數(shù)量多,分泌大量膠原纖維,組織質(zhì)密,對照組組織疏松,成纖維細胞數(shù)目相對少,分泌膠原纖維量少,而膠原纖維是硬腦膜主要組成部分,實驗組膠原纖維分泌多表明硬腦膜修復(fù)旺盛。實驗組成纖維細胞計數(shù)較對照組占據(jù)數(shù)量上優(yōu)勢,兩組比較差異有統(tǒng)計學意義,這也許是實驗組組織質(zhì)密的主要原因。術(shù)后180 d,羥丁基幾丁糖膜下新生膜中成纖維細胞計數(shù)明顯減少,與正常兔硬腦膜成纖維細胞計數(shù)比較,差異無統(tǒng)計學意義,新生膜HE染色下結(jié)構(gòu)與兔正常硬腦膜相似性高。術(shù)后180 d,生物膜組成纖維細胞計數(shù)較正常硬腦膜少,兩者比較差異有統(tǒng)計學意義,生物膜組組織疏松,較正常兔硬腦膜相似性低。
綜上所述,羥丁基幾丁糖膜修復(fù)兔硬腦膜缺損,膜下有新生膜形成,早期成纖維細胞增殖促進組織修復(fù),晚期成纖維細胞數(shù)量減少,術(shù)后180d與正常兔硬腦膜比較成纖維細胞數(shù)量差異無統(tǒng)計學意義,新生膜與兔正常硬腦膜相似性高,可以達到修復(fù)硬腦膜缺損的要求。