賈麗艷 高娟娟 荊 旭 田宇敏 王 愈 郝 林

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 山西太谷 030801）

隨著人們食品健康意識的增強，綠色食品防腐劑受到越來越多的關(guān)注。細菌素作為天然食品防腐劑已成為研究熱點[1]。細菌素（Bacteriocin）是由某些細菌通過核糖體合成，基因編碼的一類具有抗菌活性的蛋白質(zhì)，抗菌范圍不僅局限于同源的細菌，產(chǎn)生菌對其細菌素具有自身免疫性[2-3]。因其高效、無毒、耐高溫、無殘留、無抗藥性及良好的生物相容性等優(yōu)點，作為綠色生物防腐劑在農(nóng)產(chǎn)品和其它食品的保藏和農(nóng)作物安全生產(chǎn)中倍受關(guān)注[4]。考慮到細菌素產(chǎn)生菌及細菌素的安全性，到目前為止，只有乳酸菌產(chǎn)生的細菌素作為綠色防腐劑應(yīng)用于食品行業(yè)[5]。然而，乳酸菌細菌素的理化及生物學(xué)特性又限制了其廣泛應(yīng)用。新型廣譜的綠色防腐劑有待開發(fā)。

從安全的發(fā)酵食品中分離得到的食品級微生物將是開發(fā)新的食品級生物防腐劑的最好來源。山西老陳醋已有幾千年的食用歷史，食用安全性好。醋醅中棲息著多種微生物，如醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等，它們共同發(fā)酵生產(chǎn)出獨居特色的山西老陳醋。目前研究主要集中在陳醋產(chǎn)酸及風(fēng)味物質(zhì)方面的研究，而對菌株在發(fā)酵過程中的拮抗性及產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株對山西陳醋的形成和保藏方面功能研究較少[6-7]。本文從山西陳醋醋醅中分離篩選產(chǎn)抑菌物質(zhì)的細菌，對獲得的一株產(chǎn)廣譜抑菌物質(zhì)的細菌進行分類鑒定及生物學(xué)特性研究，為有效利用醋醅中微生物資源，開發(fā)研制產(chǎn)廣譜、綠色生物防腐劑的微生態(tài)制劑及抑菌物質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及材料 篩選材料：山西省清徐老陳醋醋廠新鮮醋醅。

指示菌：大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌 （Staphylococcus sp.）、芽孢桿菌SH108（Bacillus sp.SH 108），山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保藏。

1.1.2 主要試劑 過氧化氫酶 （2 000～5 000 U/mg），美國Sigma公司；蛋白酶 K（2 000～5 000 U/mg），北京solarbio公司；DNA快速抽提試劑盒（細菌），上海生工生物工程有限公司；其它化學(xué)試劑均為常規(guī)試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：牛肉膏基礎(chǔ)培養(yǎng)基[8]。

種子培養(yǎng)液及發(fā)酵培養(yǎng)液：葡萄糖1 g，酵母浸膏 1 g，蒸餾水 100 mL[9]。

指示菌生長培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基[8]。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離 采用倍比稀釋平板涂布法對新鮮醋醅中細菌進行分離篩選。取10 g新鮮醋醅，置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，充分振蕩30 min，靜置5 min。制備10-2到10-6的系列稀釋液，取100 μL涂布固體培養(yǎng)基平板，并置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。待單菌落出現(xiàn)后，劃線法轉(zhuǎn)接至斜面固體培養(yǎng)基培養(yǎng)后4℃保藏[10]。

1.2.2 產(chǎn)高效抑菌物質(zhì)菌株的篩選 采用雙層牛津杯法[11-12]。

1.2.3 發(fā)酵液酸抑菌排除試驗 向兩個小燒杯中加入適量蒸餾水，用36%乳酸和80%乙酸分別調(diào)節(jié)蒸餾水的pH，使其pH與產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株發(fā)酵液的pH相同。取200 μL配置好的乳酸溶液、乙酸溶液于牛津杯中做抑菌試驗，指示菌為芽孢桿菌SH108。

1.2.4 發(fā)酵液過氧化氫抑菌排除試驗 采用過氧化氫酶排除過氧化氫法[13]處理發(fā)酵液。取去過氧化氫發(fā)酵上清液做抑菌試驗，指示菌為芽孢桿菌SH108。

1.2.5 發(fā)酵液蛋白類抑菌物質(zhì)定性試驗 采用蛋白酶消化法[14]處理去過氧化氫發(fā)酵液。取蛋白酶消化后的發(fā)酵上清液做抑菌試驗，指示菌為芽孢桿菌SH108。

1.2.6 菌株對蛋白類抑菌物質(zhì)的免疫性試驗 取200μL過氧化氫酶處理后的發(fā)酵上清液，做牛津杯抑菌試驗。產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株為指示菌，指示菌為芽孢桿菌SH108。

1.2.7 菌株生長和蛋白類抑菌物質(zhì)生成曲線的構(gòu)建 采用發(fā)酵用培養(yǎng)液培養(yǎng)產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株，每間隔6 h測定發(fā)酵液的吸光值（OD600），同時，通過牛津杯法測定去過氧化氫發(fā)酵液的抑菌活性。指示菌為芽孢桿菌SH108。根據(jù)結(jié)果構(gòu)建菌株生長曲線及蛋白類抑菌物質(zhì)生成曲線。

1.2.8 菌株的鑒定

1.2.8.1 形態(tài)學(xué)觀察及理化特性分析 理化性質(zhì)及形態(tài)學(xué)分類：按照文獻[9-10]做形態(tài)與生理生化分析。

1.2.8.2 16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育分析 采用上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)的基因組DNA快速抽提試劑盒 （細菌）提取待測指示菌的基因組DNA。采用擴增細菌16S rDNA 的通用引物（正向引物27 F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；反向引物 1512R：ACGGCTACCTTGTTACGACT）對細菌基因組DNA進行PCR擴增。獲得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后送上海生工生物工程有限公司測序。測序完成后，將得到的序列登陸http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank 進行 BLAST，選取數(shù)據(jù)庫中有代表性的菌株16S rDNA，采用clustalx1.83軟件的Multiple Sequence Alignment程序進行同源性序列比對；采用MEGA5.05軟件，以鄰接法 （Neighbour-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（Bootstrap=1 000）[9]。

1.2.9 菌株生物學(xué)特性研究

1.2.9.1 乙醇含量對菌株生物量的影響 將菌株接種于乙醇含量為0%，2%，4%，6%，8%和10%的發(fā)酵培養(yǎng)液中，30℃條件下培養(yǎng)48 h后分別測定OD600值。

1.2.9.2 溫度對菌株生物量的影響 將待測菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中，分別在 30，35，40，45，50℃條件下培養(yǎng)48 h后，分別測定OD600值。

1.2.9.3 pH值對菌株生物量的影響 將待測菌種接種于初始 pH 值分別為 1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的發(fā)酵培養(yǎng)液中，30℃條件下培養(yǎng)24 h后分別測定OD600。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)廣譜抑菌物質(zhì)菌株的篩選

通過牛津杯法篩選醋醅中產(chǎn)抑菌物質(zhì)菌株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株細菌對革蘭氏陰性菌大腸桿菌、革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌及芽孢桿菌具有抑制作用。該菌株保藏于中國普通微生物菌種保藏管理 中 心 （China General Microbiological Culture Collection Center），編號 CGMCC6624。

2.2 酸抑菌排除試驗

圖1 細菌CGMCC6624抑菌性Fig.1 The antibacterial property of CGMCC6624

細菌CGMCC 6624發(fā)酵液pH為6。分別配制pH 6的乳酸溶液和乙酸溶液做牛津杯抑菌試驗。由圖2可知，含有pH 6的乳酸溶液、乙酸溶液的牛津杯周圍無抑菌圈出現(xiàn)，表明pH 6的乳酸溶液、乙酸溶液無抑菌性，由此可以排除發(fā)酵液中酸抑制指示菌生長的可能。

2.3 過氧化氫抑菌排除試驗

細菌CGMCC 6624發(fā)酵液經(jīng)過氧化氫酶消化后，抑菌圈略有變?。▓D3），表明發(fā)酵液中含有過氧化氫。過氧化氫的存在，可抑制細菌的生長。但是，過氧化氫酶消化后，抑菌圈沒有完全消失，表明發(fā)酵液中除過氧化氫外，還有其它物質(zhì)可以抑制指示菌的生長。

圖2 酸抑菌排除試驗Fig.2 Testing of excluding the effects of organic acids

2.4 蛋白酶對抑菌物質(zhì)的影響

細菌CGMCC 6624發(fā)酵液經(jīng)過氧化酶處理后，用蛋白酶K（proteinase K）水解發(fā)酵液，結(jié)果顯示發(fā)酵液經(jīng)蛋白酶K水解后抑菌圈完全消失 （圖4），表明發(fā)酵液中除過氧化氫外，還有蛋白類抑菌物質(zhì)存在。

2.5 細菌CGMCC 6624對蛋白類抑菌物質(zhì)的免疫性

去過氧化氫發(fā)酵液在含有指示菌CGMCC 6624的培養(yǎng)基上不能形成抑菌圈，表明細菌CGMCC 6624對其發(fā)酵液中的抑菌蛋白具有自身免疫性。

圖3 過氧化氫抑菌排除試驗Fig.3 Testing of excluding the effects of H2O2

2.6 抑菌蛋白的生成與細菌CGMCC 6624生長的關(guān)系

圖4 蛋白酶對抑菌物質(zhì)的影響Fig.4 Effect on of proteinase to antibacterial material

圖6 細菌CGMCC 6624生長及抑菌蛋白生成曲線Fig.6 Curves on Growth of CGMCC 6624 and production of antimicrobial protein

發(fā)酵時間對細菌CGMCC 6624分泌的抑菌蛋白有很大的影響 （圖6）。隨著細菌CGMCC 6624生長和繁殖，抑菌蛋白的產(chǎn)生逐漸增多，在培養(yǎng)48 h左右達到最大；隨著時間的推移，抑菌活性又逐漸減小，表明培養(yǎng)后期蛋白抑菌活性下降，推測抑菌蛋白被細菌分泌的蛋白酶酶解或者是被菌體表面吸附沉淀[16]。微生物在其生命活動過程中，能合成各種各樣的代謝產(chǎn)物。依據(jù)代謝產(chǎn)物與微生物自身生長的關(guān)系，代謝產(chǎn)物可以分為初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)物是初級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)物形成與菌體生長分不開，呈一定正相關(guān)；次級代謝產(chǎn)物則相反，與菌株的生長相比具有一定的滯后性[15]。由此可以推測抑菌蛋白為細菌CGMCC 6624的初級代謝產(chǎn)物。細菌素是由細菌產(chǎn)生的蛋白或多肽類初級代謝產(chǎn)物[1]。細菌CGMCC 6624產(chǎn)生的蛋白類抑菌物質(zhì)符合以上要求，所以確定為細菌素。

圖5 抑菌蛋白對細菌CGMCC 6624活性的影響Fig.5 Effect on strain CGMCC 6624 to antimicrobial protein

2.7 細菌CGMCC 6624的鑒定

2.7.1 形態(tài)特征 細菌CGMCC 6624呈桿狀，單個、成對或成鏈排列（圖7a），0.6～0.85 μm×1.5～3.5 μm，有莢膜（圖7b），無鞭毛，有芽孢，芽孢呈橢圓形（圖7c）；菌落圓形，邊緣整齊，凸起，光滑，透明，無色素產(chǎn)生（圖8）。

2.7.2 生理生化鑒定 細菌CGMCC 6624的各項生理生化鑒定結(jié)果見表1。

2.7.3 16Sr DNA鑒定 以細菌CGMCC 6624的總DNA為模板，使用一對細菌通用引物擴增出長約1 542 bp的片段，登錄GenBank序列號（Accession No） 為 JX025646。將該序列登陸http：//www．GenBank．com 進行BLAST比對，結(jié)果顯示細菌CGMCC 6624與芽孢桿菌屬具有較高的序列相似性，達到99%。從圖9的發(fā)育樹可以看出，細菌CGMCC 6624的遺傳進化距離與Bacillus subtilis親緣關(guān)系較近。綜合細菌CGMCC 6624的培養(yǎng)特征、生理生化特性和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，將其初步確定為枯草芽孢桿菌。

圖7 細菌CGMCC 6624的個體形態(tài)特征Fig.7 Micrographic of strain CGMCC 6624

圖8 細菌CGMCC 6624菌落形態(tài)Fig.8 Colony of strain CGMCC 6624

表1 細菌CGMCC 6624的生理生化特性Table1 The hysiological and biochemistry characteristics of CGMCC 6624

圖9 依據(jù)16S rDNA基因序列構(gòu)建的細菌CGMCC 6624系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain CGMCC 6624

2.8 細菌CGMCC 6624生物學(xué)特性研究

乙醇含量、初始pH值、培養(yǎng)溫度對細菌CGMCC 6624生物量的影響見圖10。乙醇對CGMCC 6624細菌生長具有一定的影響，當(dāng)乙醇含量在8%以下，菌體能生長繁殖，10%以上菌體生長繁殖受到抑制（圖10a）。調(diào)節(jié)發(fā)酵培養(yǎng)液的初始pH，結(jié)果表明pH值對菌種生物量的影響范圍較寬，在pH 3至10之間菌體均可生長，pH 5.5時菌體生物量達到最大值（圖10b）。培養(yǎng)溫度對菌株CGMCC 6624生物量的影響較大，菌體在30℃菌體生長快，35℃以上生長繁殖逐漸變緩，60℃時菌株不生長繁殖（圖10c）。

圖10 乙醇含量、pH值、溫度對菌株 CGMCC 6624生物量的影響Fig.10 Effect on the growth conditions of CGMCC 6624

3 結(jié)論

從醋醅中分離得到1株具有廣譜抑菌活性的細菌CGMCC 6624，所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對大腸桿菌、葡萄球菌、芽孢桿菌都有較強的拮抗作用。

結(jié)合酸抑菌排除試驗、過氧化氫抑菌排除試驗、蛋白酶消化抑菌物質(zhì)試驗，抑菌蛋白生成與細菌CGMCC 6624生長曲線的關(guān)系及細菌CGMCC 6624對抑菌蛋白生長免疫特性的研究，確定細菌CGMCC 6624產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)除過氧化氫外主要為蛋白質(zhì)類物質(zhì)--細菌素。

乙醇含量、初始pH值、培養(yǎng)溫度對細菌CGMCC 6624生長具有一定的影響，其在pH 5，溫度30℃，乙醇含量為0的發(fā)酵培養(yǎng)液中生長良好；可以耐受pH 3～11，且堿性條件下生長優(yōu)于酸性條件；最高耐受溫度為50℃；最高耐受乙醇體積分?jǐn)?shù)為8%。

以上研究將為該菌株在醋醅發(fā)酵過程中的應(yīng)用及其微生物制劑和細菌素的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。