尤 娟 姜雪英 尹 濤 胡 楊 黃琪琳 熊善柏 *

（1 華中農(nóng)業(yè)大學食品科技學院 武漢 430070

2 國家大宗淡水魚加工技術研發(fā)分中心 武漢 430070）

鰱魚是我國淡水魚中分布最為廣泛的魚類，全國產(chǎn)量從1999年的306.2萬t增長到2016年的450.7萬t[1]。由于鰱魚產(chǎn)量大且價格低廉，所以已成為淡水魚魚糜的主要加工原料。為防止魚糜在凍藏過程中發(fā)生冷凍變性，導致魚糜綜合品質(zhì)下降，一些糖及糖醇類物質(zhì)被作為冷凍變性保護劑添加到魚糜中[2]。葡聚糖是一種高分子質(zhì)量的中性多糖，具有甜度低、熱量小的特點，可代替蔗糖等高熱量糖而用于魚糜的抗凍保護。魯耀彬等[3]比較了葡聚糖和傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑對凍藏過程中肌原纖維蛋白的冷凍保護效果，得出小分子質(zhì)量的葡聚糖對淡水魚及相關制品的冷凍保護效果較好。另有研究者[4-6]報道葡聚糖具有增強人體免疫力、抗輻射、抑菌等功能。余文熙等[7]在鯖魚魚丸中添加葡聚糖以增強其質(zhì)構特性并起到防腐保鮮的效果。將葡聚糖添加在魚糜及其制品中具有多方面的優(yōu)勢。然而，加工魚糜制品的過程中需經(jīng)加熱等工序，在此過程中葡聚糖可與蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應。

糖基化反應是由蛋白質(zhì)的游離氨基和還原糖的羰基發(fā)生的非酶促褐變的化學反應[8]。葡聚糖與許多蛋白質(zhì)如乳清蛋白[9]、豬血蛋白[10]、大米蛋白[11]、蕎麥蛋白[12]的糖基化反應對它們功能特性的影響已有較多的研究。在水產(chǎn)領域，張愛榮[13]、蘆晶等[14]、陳欣[15]及尤娟[16]等研究了糖基化反應對魚肉肌原纖維蛋白溶解性、乳化性等功能特性的影響。然而葡聚糖的糖基化反應對魚糜制品凝膠特性的影響還較有限。鄧海萍等[17]研究了3種電荷多糖添加物（殼聚糖、葡聚糖、卡拉膠）對鰱魚糜凝膠結構的影響，沒有注意到發(fā)生的糖基化反應以及該反應對魚糜凝膠特性的影響。本文以白鰱魚糜為原料，研究葡聚糖在魚糜凝膠制備過程中的糖基化反應程度及糖基化反應對魚糜凝膠特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

新鮮鰱魚，購自華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)貿(mào)市場。葡聚糖，分子質(zhì)量10 000 u，購于上海源葉生物科技有限公司。其它試劑均屬于分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 魚糜凝膠的制備

參考郭秀瑾等[18]的方法，將新鮮鰱魚脊背白肉采下后攪碎，加入4倍體積的冰水攪拌5 min后靜置10 min，傾去液體，重復3次，得沉淀。再向沉淀中加入4倍體積0.5%NaCl溶液，傾去液體，重復兩次。將沉淀以5 000 r/min離心10 min，得到魚糜，控制魚糜含水量在80%。將魚糜放入斬拌機中斬拌，依次進行空斬2 min、加入一定比例的葡聚糖后斬2 min，再加入2.5%鹽斬拌3 min后制得魚糜與葡聚糖混合物，其中葡聚糖的添加量按照肌原纖維蛋白干基質(zhì)量的0倍、0.5倍、1倍、2倍加入。將混合物抽真空除去空氣后利用制腸機灌進腸衣，再將不同糖比例的腸放入40℃分別反應0，2，4，6，8 h，然后在 40℃水浴 1 h 后再于 90℃水浴0.5 h制成魚糜凝膠，冷藏備用。

1.3 pH的測定

將上述樣品的初始pH調(diào)至8.2，糖基化反應的發(fā)生會引起體系pH的變化，故采用梅特勒pH計測定糖基化反應后體系的pH。

1.4 反應中間產(chǎn)物和褐變程度的測定

將糖基化反應后樣品加一定量水搗碎后以5 000 r/min離心10 min，取上清液，利用721型-紫外分光光度計分別在420 nm和294 nm下測定其吸光值。294 nm下的吸光值即為糖基化反應中有紫外吸收的中間產(chǎn)物，420 nm下的吸光值即為糖基化反應的褐變程度。

1.5 凝膠強度的測定

參考郭秀瑾等[18]的方法，將制備好的魚糜凝膠切成高2 cm的柱狀體，用TA-XT Plus質(zhì)構儀的穿刺模式進行測定。

1.6 微觀結構的觀察

參考馬瑤蘭等[19]的方法，采用高倍掃描電鏡，在10 000倍的放大倍數(shù)下，觀察魚糜凝膠的網(wǎng)絡結構。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

試驗重復3次，每次試驗根據(jù)要求做3個或5個平行，應用Excel（2012）作圖。對采集的試驗數(shù)據(jù)采用 SAS 8.0統(tǒng)計分析 （SAS 8.0，Institute Inc.，Cary，NC，USA）進行相關性分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 糖基化反應時間和糖比例對魚糜凝膠pH的影響

通過圖1可以看出，未加葡聚糖的魚糜凝膠pH值在反應2 h后，沒有顯著性降低；而添加了葡聚糖的魚糜凝膠pH值隨著糖基化反應時間的延長逐步顯著降低（P＜0.05）。糖基化反應是由蛋白質(zhì)上游離的氨基與糖的羰基反應，氨基被消耗且反應過程中產(chǎn)生了甲酸、乙酸等有機酸，因此反應的pH逐步降低[16]。由此可以說明魚糜和葡聚糖的混合物在40℃下發(fā)生了糖基化反應，導致整個體系的pH逐步降低，且隨著反應時間的延長，糖基化反應程度越高。當葡聚糖添加比例越大，經(jīng)過反應后魚糜凝膠pH值降低的越多，說明糖基化反應越顯著。You等[20]在研究5種糖（木糖、半乳糖、葡萄糖、葡聚糖、低聚異麥芽糖）與水溶性蛋白的糖基化反應時得出了相一致的結果。由此可以得出，反應時間與葡聚糖添加比例對糖基化反應均有影響。在試驗條件內(nèi)，加熱時間的增長和加糖比例的增大均會加速糖基化反應的進行。加糖量越高，游離的可被利用的羰基就越多，反應物接觸越多；加熱時間越長，基團反應就越徹底，糖基化反應就越劇烈[8]。

2.2 糖基化反應時間和糖比例對魚糜凝膠褐變程度和中間產(chǎn)物的影響

420 nm吸光值表征了Maillard反應中有色基團的生成量，使體系呈現(xiàn)出褐色，是反應Maillard反應進程的一個重要指標[20]。圖2反應了糖基化反應時間和葡聚糖添加比例對魚糜凝膠褐變程度的影響。隨著反應時間的延長，沒有添加葡聚糖的魚糜凝膠在420 nm下的吸光值沒有顯著性變化（P＞0.05），而添加了葡聚糖的魚糜凝膠在420 nm下的吸光值均隨著反應時間的延長而升高。對于蛋白與葡聚糖比例分別為2∶1和1∶1的魚糜凝膠，其420 nm吸光值在前4 h內(nèi)顯著性升高（P＜0.05），而后沒有顯著性變化（P＞0.05）?？赡苁堑鞍缀推暇厶窃谇? h反應劇烈，4 h后可以反應的底物逐漸減少，反應減慢，褐變速率變小。而蛋白與葡聚糖比例為1∶2的魚糜凝膠，420 nm下吸光值顯著上升，當反應時間達到8 h后吸光值略有下降，可能是因為反應時間過長，糖基化反應進入第3個階段，生成了不易溶解的產(chǎn)物[21]，導致吸光值略有降低。當反應時間相同時，2∶1和1∶1兩個比例魚糜凝膠的吸光值沒有顯著性差異，而蛋白和糖的比例為1∶2時魚糜凝膠吸光值高于其它比例的凝膠，說明1∶2比例的魚糜凝膠褐變程度較大，糖基化反應程度較高。

圖1 糖基化反應時間和葡聚糖比例對魚糜凝膠pH的影響Fig.1 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on pH of surimi gel

圖2 糖基化反應時間和葡聚糖比例對魚糜凝膠褐變程度的影響Fig.2 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on the browning of surimi gel

在糖基化反應過程中，氨基酸和還原糖反應使得有紫外吸收峰的物質(zhì)生成，且該物質(zhì)可在294 nm下被檢測到，因此可以用294 nm的吸光值來監(jiān)測糖基化反應的程度[16]。如圖3所示，糖基化反應時間為0 h的4個不同比例樣品的吸光值無顯著性差異（P＞0.05）。隨著反應時間的延長，沒有添加葡聚糖的魚糜凝膠在294 nm下的吸光值沒有顯著性變化（P＞0.05），而添加了葡聚糖的魚糜凝膠在294 nm下的吸光值均隨著反應時間的延長而逐漸升高。對于蛋白與葡聚糖比例為2∶1和1∶1的魚糜凝膠，其294 nm吸光值在前2 h內(nèi)顯著性升高（P＜0.05），而后沒有顯著性變化（P＞0.05）。而蛋白與葡聚糖比例為1∶2的魚糜凝膠，294 nm下吸光值顯著上升，當反應時間達到8 h后吸光值略有下降。該趨勢與其420 nm吸光值變化相一致，同樣說明在2∶1和1∶1的比例下葡聚糖2 h內(nèi)可能反應消耗。當反應時間相同時，糖基化的魚糜凝膠吸光值顯著高于未添加葡聚糖的魚糜凝膠，且2∶1和1∶1兩個比例魚糜凝膠的吸光值沒有顯著性差異，而蛋白和糖的比例為1∶2時魚糜凝膠吸光值高于其它比例的凝膠，說明1∶2的樣品糖基化反應最為活躍。

圖3 糖基化反應時間和葡聚糖比例對魚糜凝膠糖基化反應中間產(chǎn)物的影響Fig.3 Effects of glycosylation reaction time and dextran ratio on the content of intermediate products of glycosylation in surimi gel

2.3 反應時間和糖比例對魚糜凝膠強度的影響

葡聚糖添加量和糖基化反應時間對魚糜凝膠強度的測定結果如圖4所示。隨著糖基化反應時間的延長，沒有添加葡聚糖的魚糜凝膠的破斷力明顯降低（P＜0.05），當反應時間延長至6 h后其破斷力沒有顯著變化（P＞0.05）；而添加了葡聚糖的魚糜凝膠的破斷力在反應8 h內(nèi)均沒有顯著性變化（P＞0.05）。說明40℃前先加熱魚糜凝膠會使得魚糜凝膠的硬度降低，但葡聚糖的添加有利于增強魚糜凝膠的熱穩(wěn)定性。álvarez等[10]在研究豬血蛋白通過葡聚糖糖基化修飾時也得出豬血蛋白的熱穩(wěn)定性和乳化活性都得到提高，而凝膠強度比未糖基化的豬血蛋白降低了50%。這可能是因為葡聚糖阻礙了蛋白與蛋白之間的作用，保護了蛋白的初始結構，葡聚糖的存在降低了溶解蛋白溶液的流動性，使得蛋白處在一種相對緊湊穩(wěn)定的狀態(tài)，熱穩(wěn)定性增強[22]。在0～8 h的反應時間段里，添加葡聚糖的魚糜凝膠破斷力遠小于未添加葡聚糖的魚糜凝膠破斷力，并且隨著葡聚糖添加比例的增加，魚糜凝膠在各個反應時間內(nèi)的破斷力均呈現(xiàn)顯著降低的趨勢。

破斷力反映的是魚糜凝膠的硬度，而凹陷深度則可反映魚糜凝膠的彈性[19]。由圖4（b）可以看出，隨著糖基化反應時間的延長，未添加葡聚糖的魚糜凝膠的凹陷深度緩慢降低，當加熱時間達到6 h時顯著降低；隨著反應時間的延長，添加了葡聚糖的魚糜凝膠凹陷深度沒有顯著性差異。在反應前4 h內(nèi)，添加了葡聚糖的魚糜凝膠凹陷深度顯著低于相應時長下未添加葡聚糖的魚糜凝膠（P＜0.05），在反應后 4 h，比例為 2∶1 添加葡聚糖的魚糜凝膠凹陷深度相對較大。說明葡聚糖的添加和加熱會減弱魚糜凝膠網(wǎng)絡結構的形成，可能是因為葡聚糖和魚糜蛋白的氨基反應，減少了TGase促進的交聯(lián)網(wǎng)絡形成的可能。另一方面，葡聚糖使蛋白分子與蛋白分子之間存在較大的空間位阻，降低了二硫鍵或蛋白分子疏水相互作用促進的交聯(lián)網(wǎng)絡結構形成的可能[10]。

由圖4（c）所示，葡聚糖添加和反應時間對魚糜凝膠強度的影響與破斷力的變化趨勢較一致。隨著反應時間的延長，未添加葡聚糖的魚糜凝膠強度顯著性降低（P＜0.05），反應6 h后，沒有顯著性變化；而添加了葡聚糖的魚糜凝膠強度在反應的8 h內(nèi)均沒有顯著性差異（P＞0.05）。在糖基化反應的前4 h內(nèi)，隨著葡聚糖的添加比例的增大，魚糜凝膠強度顯著性降低（P＜0.05）；在反應的后4 h內(nèi)，葡聚糖添加比例為2∶1的魚糜凝膠強度沒有顯著性變化，且高于未添加葡聚糖的魚糜凝膠強度。說明葡聚糖的添加會導致魚糜形成凝膠的能力下降，凝膠強度下降的原因是葡聚糖與魚糜蛋白進行糖基化反應，反應活性越強，對于體系凝膠網(wǎng)絡結構的改變就越大，導致凝膠網(wǎng)絡弱化，這一結果與María等[23]研究的結果類似，即糖基化反應活性最高的多糖與蛋白質(zhì)形成的復合凝膠最弱。

圖4 反應時間和葡聚糖比例對魚糜凝膠破斷力（a）、凹陷深度（b）及凝膠強度（c）的影響Fig.4 Effects of reaction time and sugar ratio on the breaking force （a），penetration distance （b） and gel strength （c） of surimi gel

2.4 反應時間和糖比例對魚糜凝膠微觀結構的影響

魚糜凝膠的微觀結構是影響其凝膠強度的重要因素。圖5顯示了不同葡聚糖添加量及糖基化反應時間下所制得的魚糜凝膠的掃描電子顯微鏡圖。由圖5可知，在反應前2 h內(nèi)，未添加葡聚糖的魚糜凝膠具有較完整且致密、規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡結構，反應4 h后魚糜凝膠變得粗糙、不均勻，甚至出現(xiàn)片狀結構，長時間的加熱不利于魚糜形成較好的網(wǎng)絡結構，其凝膠網(wǎng)絡的破壞與肌球蛋白重鏈被蛋白酶水解有關[18]。添加了葡聚糖的魚糜凝膠的微觀結構沒有較完整致密的凝膠網(wǎng)絡結構。葡聚糖添加比例為2∶1的魚糜凝膠有較稀疏的網(wǎng)絡結構，且隨著反應時間的延長，凝膠的孔徑稍有變大，有細小的團聚體出現(xiàn)在稀疏的網(wǎng)絡節(jié)點上；葡聚糖添加比例為1∶1和1∶2的魚糜凝膠從反應開始就形成了細小且均勻的小球體并聚集成團，隨著反應時間的延長，聚集團沒有顯著差異，且沒有形成有規(guī)則的凝膠網(wǎng)絡結構。

魚糜形成凝膠的過程分為兩個階段，第1階段是加熱魚糜蛋白質(zhì)使其發(fā)生一定程度的變性和伸展，肌球蛋白尾部解螺旋，暴露的一些氫鍵和疏水基團通過非共價鍵結合，第2階段是各暴露的巰基、游離氨基等功能基團之間形成穩(wěn)定的共價鍵，于是產(chǎn)生了凝膠網(wǎng)絡結構[8]。未添加葡聚糖的魚糜凝膠在加熱過程中經(jīng)歷這兩個階段，然而隨著加熱時間的延長，由于魚糜凝膠中內(nèi)源酶的作用使魚糜凝膠劣化[24]，凝膠網(wǎng)絡結構被破壞，出現(xiàn)局部呈片狀結構，局部有網(wǎng)絡結構。而添加了葡聚糖后，在加熱的情況下，魚糜蛋白和葡聚糖發(fā)生糖基化反應，將魚糜蛋白上的游離氨基基團消耗，糖基化反應會產(chǎn)生甲酸、乙酸等中間產(chǎn)物降低環(huán)境的pH值，影響凝膠網(wǎng)絡結構的形成。另一方面，葡聚糖上含有較多的游離羥基基團，易于與魚糜蛋白質(zhì)伸展暴露的基團形成氫鍵等，從而占用了膠凝作用本身應該形成氫鍵的位點，使得凝膠網(wǎng)絡無法正常形成，從而降低了蛋白質(zhì)的凝膠性質(zhì)。

圖5 反應時間和葡聚糖比例對魚糜凝膠微觀結構的影響Fig.5 Effects of reaction time and sugar ratio on the microstructure of surimi gel

3 結論

未添加葡聚糖制備的魚糜凝膠（CK組）的pH、凝膠強度及微觀網(wǎng)絡致密度隨著加熱時間的延長而顯著降低。與CK組相比，葡聚糖添加量越多，制備的魚糜凝膠的凝膠特性越弱，但隨著加熱時間的延長，其凝膠特性沒有顯著性差異。因此，葡聚糖在魚糜加熱過程中與魚糜蛋白發(fā)生了糖基化反應，且葡聚糖的添加降低了魚糜的凝膠特性，但增強了魚糜凝膠在加熱過程中的穩(wěn)定性。