馮麗萍,熊 煒,高 誠,魏曉鋒?

(1. 上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心,上海 201203; 2. 上海海關(guān),上海 200135)

20 世紀(jì)50 年代在日本仙臺發(fā)現(xiàn)仙臺病毒,該病毒是一種小鼠副流感病毒1 型,首先從用于傳代人類患者樣本的小鼠中分離到,引起病毒起源的混淆。 現(xiàn)在普遍認(rèn)為仙臺病毒是小鼠的病原體,而不是人類的。 仙臺病毒是副粘病毒屬的成員,與其他副粘病毒一樣,它也是一種包膜病毒,具有非分段的負(fù)鏈RNA 基因組[1]。 仙臺病毒可自然感染小鼠并引起小鼠肺炎或呈隱性感染,干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果,需要被嚴(yán)格控制。 國標(biāo)規(guī)定清潔級和SPF 級實(shí)驗(yàn)小鼠必須定期檢測仙臺病毒,目前國標(biāo)檢測方法主要是血清學(xué)檢測方法,包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA),免疫酶試驗(yàn)(IEA),血凝抑制試驗(yàn)(HAI)和免疫熒光試驗(yàn)(IFA)等[2]。 這些方法通常耗時(shí)費(fèi)力,靈敏度低。 隨著分子檢測技術(shù)的進(jìn)步,大量基于基因擴(kuò)增的分析應(yīng)用于檢測仙臺病毒[3-5],如逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR),實(shí)時(shí)PCR,環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)等。 此類方法需要昂貴的熱循環(huán)儀和經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員,檢測時(shí)間較長很難在現(xiàn)場實(shí)施。

本研究中實(shí)時(shí)熒光重組酶等溫?cái)U(kuò)增(real-time fluorescence recombinase polymerase amplification,real-time RPA)是一種快速靈敏的分子檢測方法,適用于現(xiàn)場檢測。 近年來已經(jīng)成功開發(fā)多種實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測方法,用于快速檢測不同病原體檢測,如空腸彎曲桿菌、豬圓環(huán)病毒2 型、口蹄疫病毒、豬流行性腹瀉病毒、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等[6-10]。該方法可通過簡單的儀器在25 min 甚至更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SeV 及陽性核酸來自本實(shí)驗(yàn)室保存。 本研究中使用的其他病原微生物如小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)、呼腸孤病毒Ⅲ型(reovirus type III, Reo-3)、 肺 炎 克 雷 伯 桿 菌(Klebsiella pneumoniae, KP)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus, SA)、 嗜 肺 巴 斯 德 桿 菌( Pasteurella pneumotropica, PP )、 綠 膿 桿 菌( Pseudomonas aeruginosa, PA)等來自本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑與儀器

DNA Marker(DL1000)、RNA 酶抑制劑、dNTP、反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自TaKaRa 公司;病毒RNA 快速抽提試劑盒購自生工生物公司;TwistAmp exo 試劑盒購自英國TwistDx 公司;Genie? II 等溫?cái)U(kuò)增熒光檢測系統(tǒng)購自英國OptiGene 公司;PCR 儀Biometra T-gradient Thermoblock; 凝膠成像系統(tǒng) Bio-Rad Universal Hood II。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核酸提取及模板制備

核酸提取：取0. 2 mL 待檢上清液或血清,加0. 6 mL buffer Rlysis-VG 試劑進(jìn)行RNA 提取,室溫放置10 min,震蕩后加入0. 7 mL 異丙醇;離心15 min 后移除上清;加入1 mL 70%乙醇,震蕩后離心5 min,移除上清;加入0. 2 mL RNase-free 水溶解RNA 沉淀,樣品可直接取用,也可以保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

模板制備：取2 μL RNA 溶液,dNTP Mixture 1 μL、隨機(jī)引物1 μL、RNase-free H2O 6 μL,PCR 儀上變性、退火反應(yīng)：65℃5 min;4℃。 在此反應(yīng)液中加入buffer 4 μL、RNA 酶抑制劑0.5 μL、RTase 0.5 μL、RNase-free H2O 5 μL,再次放回PCR 儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：30℃10 min;42℃30 min;95℃5 min;4℃,即得cDNA 模板,樣品可直接取用,也可以保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光RPA 引物及探針設(shè)計(jì)

針對SeV 融合蛋白編碼基因的保守序列設(shè)計(jì)引物及探針[1],實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測引物和探針由上海輝睿生物科技有限公司合成。 上游引物SENVFP： 5’-AAA TCT ATA GAA CTG CTG CAA AAC GCT GTG GG-3’;下游引物SENV-RP： 5’-TTG TGT CAG TTT TAT CCC CAG TCT TAA AGC GG-3’;RPA探針SENV-P： 5’-GAA CAA ATT CTT GCT CTA AAG ACG CTC CAG GAT (FAM) -T-T(BHQ1) CGT GAA TGA TGA GAT CAA AC-PO4-3’。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光RPA 反應(yīng)體系及程序

反應(yīng)體系為：使用TwistAmp exo 干粉試劑盒,總體積50 μL,29.5 μL 反應(yīng)緩沖液、上下游引物各2.1 μL、10 μmol/L 熒光探針0.6 μL、模板2 μL、水11.2 μL,將預(yù)混液混合均勻;使用微型旋轉(zhuǎn)離心機(jī)快速離心,混勻后加入干粉中;最后加入2.5 μL 280 mmol/L 醋酸鎂,小心關(guān)閉蓋子,上下顛倒混合10次,離心20 s。 參照說明書TwistAmp exo quick guide part number： TAEXO02Guide/ Revision B 即可。

反應(yīng)程序?yàn)椋?9℃孵育25 min。 反應(yīng)中即可同步呈現(xiàn)熒光擴(kuò)增曲線,根據(jù)曲線進(jìn)行結(jié)果判定。

1.3.4 SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA 方法特性的分析

特異性分析：將SeV cDNA 和其他對照病原微生物(小鼠肝炎病毒、呼腸孤病毒Ⅲ型、肺炎克雷伯桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌等),以及空白對照組(雙蒸水替代模板),使用SeV實(shí)時(shí)熒光RPA 方法擴(kuò)增,觀察結(jié)果。

敏感性分析：將SeV cDNA 進(jìn)行10 倍倍比稀釋,獲得濃度范圍是100 ng/μL 到100 fg/μL 的濃度梯度,和空白對照組同時(shí)使用SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA方法擴(kuò)增,觀察隨時(shí)間推移的熒光信號累積。

穩(wěn)定性和可靠性分析：在不同時(shí)間進(jìn)行7 次獨(dú)立的實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測,模板濃度范圍是100 ng/μL 到100 fg/μL 的10 倍倍比稀釋的濃度梯度,觀察檢出濃度及檢出時(shí)間,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 檢出率應(yīng)用SPSS 在線Probit 回歸分析。 峰值時(shí)間應(yīng)用Microsoft Excel 軟件線性回歸分析。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光RPA 方法的優(yōu)勢比較

選擇實(shí)驗(yàn)動物仙臺病毒PCR 檢測方法的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行優(yōu)勢比較[3],實(shí)時(shí)熒光RPA 方法與團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)PCR 方法使用相同濃度的模板進(jìn)行擴(kuò)增,比較其兩種方法檢出濃度的下限,以及檢測全程所需的時(shí)間。

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中的方法,PCR 上游引物Sev-F180 ∶5’-ATG AAG GAC AAA GCA TTA TCG CCT A-3’;上游引物Sev-R180 ∶5’-CAA CCA GTC TCC TGA TTC CAC GTA-3’。 PCR 反應(yīng)體系和反應(yīng)程序均參照團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)[3]。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測SeV 的特異性和敏感性

SeV 核酸為單股負(fù)鏈RNA,選擇其融合蛋白編碼基因,設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物及探針并建立SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測方法。 為了評估方法的有效性及特異性,選用小鼠易感的小鼠肝炎病毒等六種病原微生物作為對照。 將所有的對照組和SeV 組同時(shí)擴(kuò)增,SeV 在反應(yīng)6 min 30 s 之后熒光信號迅速增強(qiáng),而其他組在整個(gè)反應(yīng)中均未觀察到可見的熒光信號(圖1)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明實(shí)時(shí)熒光RPA 能特異性檢測SeV,無交叉反應(yīng)。

本研究評估實(shí)時(shí)熒光RPA 的敏感性,使用10倍倍比稀釋SeV cDNA 制備濃度梯度100 ng/μL 到100 fg/μL,作為反應(yīng)的模板。 實(shí)時(shí)熒光RPA 反應(yīng)中,前四個(gè)梯度能隨著時(shí)間的推移有大量的熒光信號累積(圖2)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光RPA 擴(kuò)增中不同病原微生物的熒光信號Figure 1 Fluorescence data of different pathogenic microorganisms in real-time RPA amplification

圖2 實(shí)時(shí)熒光RPA 擴(kuò)增中SeV 稀釋梯度的熒光信號Figure 2 Fluorescence data of a dilution series of SeV in real-time RPA amplification

2.2 實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測方法的穩(wěn)定性和可靠性

基于7 次不同時(shí)間獨(dú)立的實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測結(jié)果,建立回歸分析模型。 實(shí)驗(yàn)中濃度范圍是100 ng/μL 到100 fg/μL 的濃度梯度,不同實(shí)驗(yàn)中最低檢出濃度有一定波動,波動范圍在1 ng/μL 到10 pg/μL 之間,應(yīng)用SPSS 在線Probit 回歸分析,預(yù)測濃度185 pg/μL 能達(dá)到95%檢出率(圖3),預(yù)測準(zhǔn)確率為92.59%,達(dá)到此濃度水平實(shí)時(shí)熒光RPA 檢出率能有很好的穩(wěn)定性。

峰值時(shí)間建立線性回歸分析模型,大約出現(xiàn)在6～20 min 之間(圖4)。 從峰值時(shí)間來看,只要能檢出均在20 min 內(nèi)獲知結(jié)果,超過20 min 還沒有起峰則全部未檢出,故本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)25 min 可以覆蓋所有的有效結(jié)果,不會錯失陽性結(jié)果,故結(jié)合之前特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果很好,可見達(dá)到其檢出濃度實(shí)時(shí)熒光RPA 方法不會錯判和漏判,可靠性很好。

2.3 實(shí)時(shí)熒光RPA 方法的優(yōu)勢比較

本研究PCR 方法為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)中的方法,反應(yīng)模板濃度梯度100 ng/μL 到100 fg/μL 和實(shí)時(shí)熒光RPA 模板濃度梯度相同。 PCR 產(chǎn)物電泳圖中,前四個(gè)泳道可見目標(biāo)條道(圖5)。 因此,如圖2 和圖5所示這兩種方法檢測下限一致。 PCR 反應(yīng)完成需要100 min,跑膠及拍照耗時(shí)30 min,總計(jì)130 min,而實(shí)時(shí)熒光RPA 擴(kuò)增和檢測信號是實(shí)時(shí)呈現(xiàn),全程僅需25 min,通常在6 ～20 min 之間即可觀察到結(jié)果,大大縮短了檢測時(shí)間。 另外,比起PCR 儀,實(shí)時(shí)熒光RPA 檢測儀Genie II,更加小巧輕便且自帶電池,適合現(xiàn)場檢測。

圖3 SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA 方法的檢出率Figure 3 Positive detection rate of the SeV real-time RPA assay

圖4 SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA 方法的峰值時(shí)間Figure 4 Peak time of the SeV real-time RPA assay

圖5 PCR 擴(kuò)增SeV 稀釋梯度的電泳結(jié)果Figure 5 Electrophoretic results of a dilution series of SeV in PCR amplification

3 討 論

實(shí)時(shí)熒光RPA 已被廣泛用于多種病原體的分子檢測,便于實(shí)地檢測[11-12]。 本研究中開發(fā)了SeV實(shí)時(shí)熒光RPA 方法,其特異性、敏感性、穩(wěn)定性和可靠性均可,該方法能夠快速靈敏的檢測出仙臺病毒。 實(shí)驗(yàn)中SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA 和PCR 方法檢測下限一樣,然而所需的時(shí)間相差很大,其中實(shí)時(shí)熒光RPA 全程僅需25 min,一般在6 ～20 min 內(nèi)即可觀察到結(jié)果,而PCR 則需要130 min 才能知曉結(jié)果。此外,研究中使用的便攜式檢測儀Genie II,小巧輕便,無需連接電腦,儀器自帶電池,可全天戶外無電環(huán)境工作。 實(shí)時(shí)熒光RPA 干粉試劑盒操作簡單,僅需將引物、探針和模板DNA 伴隨反應(yīng)混合液和緩沖液加入干粉中即可,減少污染。 重組酶將寡核苷酸引物與模板退火,形成穩(wěn)定的單鏈結(jié)合蛋白(SSB)結(jié)合的引物-重組酶復(fù)合物,不需要初始熱變性步驟來解開雙鏈DNA[13]。 總而言之,SeV 實(shí)時(shí)熒光RPA方法簡單,快速,便攜等特性,使其特別適用于在資源有限的環(huán)境中對可疑樣品的現(xiàn)場篩查,對于實(shí)驗(yàn)動物質(zhì)量控制具有重要的意義。