唐慶來(lái),宋 濤,韓友峰,仇 瑋,徐春璐,錢(qián)麗萍,吳鴻雁,史 烔,戴玉田1,?

(1.南京醫(yī)科大學(xué)研究生院,南京 211166; 2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院,南京 211100;3.南京醫(yī)科大學(xué)鼓樓臨床醫(yī)學(xué)院,南京 210008)

隨著男科學(xué)及神經(jīng)電生理檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展,陰莖神經(jīng)電生理檢測(cè)越來(lái)越多地應(yīng)用于男性勃起功能障礙(erectile dysfunction, ED)及早泄(premature ejaculation, PE)等性功能障礙的診治[1],陰莖體感誘發(fā)電位(penile somatosensory evoked potentials,PSEP)及陰莖皮膚交感反應(yīng)(penile sympathetic skin response, PSSR)對(duì)原發(fā)性早泄(primary PE, PPE)的分型診斷及病情評(píng)估具有重要的臨床意義[2]。而目前在原發(fā)性早泄外科治療中,選擇性陰莖背神經(jīng)切除術(shù)(selective dorsal penile neurectomy, SDN)仍存在一定的爭(zhēng)議,尤其是如何把握好切除神經(jīng)尺度的問(wèn)題未有定論[3-4],因此,結(jié)合本研究組前期的研究結(jié)果及部分領(lǐng)域術(shù)中神經(jīng)電生理監(jiān)測(cè)的研究成果[5],本研究將神經(jīng)電生理技術(shù)引入SDN 術(shù)中,觀察并分析全麻下比格犬陰莖背神經(jīng)切除過(guò)程中陰莖體感誘發(fā)電位的波形及參數(shù)變化,為進(jìn)一步探討男性SDN 術(shù)中尺度把握的方法提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

5 只成年(52 周齡)普通級(jí)雄性比格犬,體質(zhì)量(10±0.3)kg,購(gòu)自儀征安立卯生物科技有限公司[SCXK(蘇)2016-0005],飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作在南京大學(xué)附屬鼓樓醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心[SYXK(蘇)2014-0051],本實(shí)驗(yàn)?zāi)暇┕臉轻t(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)倫理審查批準(zhǔn)號(hào)：201806001。 實(shí)驗(yàn)室溫度20℃～24℃,相對(duì)濕度40%～70%。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物予以常規(guī)飼料喂養(yǎng),自由飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。 研究期間每天下午到運(yùn)動(dòng)場(chǎng)活動(dòng),使其能配合實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

本實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格遵守國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理相關(guān)規(guī)定,嚴(yán)格遵守動(dòng)物使用的3R 原則,滿足動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利以及倫理原則的要求。

1.2 主要試劑與儀器

舒泰(法國(guó),維克公司,劑型20 mg/1 mL);丙泊酚(西安,力邦制藥有限公司,劑型200 mg/20 mL);異氟烷(濟(jì)南,仁源化工有限公司,劑型100%：100 mL)。 肌電圖/誘發(fā)電位儀(美國(guó),Nicolet 公司);手術(shù)顯微鏡(上海,安信光學(xué)儀器制造有限公司);單線螺旋針一次性電極、表面電極片(西安,富德醫(yī)療電子有限公司生產(chǎn),SEAg-J-22×32);直針式一次性電極(美國(guó),Neurocare 公司);環(huán)狀電極、鱷魚(yú)夾導(dǎo)線(愛(ài)爾蘭,Natus 公司);接地線(荷蘭,VIASYS Healthcare 公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 麻醉

首先應(yīng)用舒泰10 mg/kg 肌肉注射進(jìn)行麻醉誘導(dǎo),取仰臥位,四肢固定后,耳緣靜脈穿刺,建立靜脈通路,氣管插管,通過(guò)靜脈通路按需給予丙泊酚2 mg/kg 靜脈麻醉,吸入異氟烷維持。

1.3.2 全麻后比格犬PSEP 的檢測(cè)

(1)比格犬陰莖頭體感誘發(fā)電位(glans penis somatosensory evoked potential,GPSEP)檢測(cè)：①將兩貼片電極黏貼于陰莖頭(內(nèi)含陰莖骨)兩側(cè),分別以鱷魚(yú)夾于貼片電極游離端提供電刺激;②右前肢備皮、消毒后以螺旋針式電極置于比格犬的前肢作為接地電極位置;③比格犬頭部及前額部備皮、消毒后參照人體國(guó)際10-20 系統(tǒng)電極放置法,將針式電極斜行刺入CZ(中央頭頂)后2 cm 處及前額中線,兩側(cè)眉弓連線中點(diǎn)略上FPz 處;④確認(rèn)電極阻抗＜5 kΩ,將各參數(shù)設(shè)定如下：矩形電流脈沖持續(xù)時(shí)間1.00 ms,頻率3 Hz;⑤調(diào)節(jié)電流刺激強(qiáng)度15 mA,行200 次疊加,電刺激引發(fā)第一個(gè)向上的波峰所需的時(shí)間即為GPSEP 潛伏期;⑥重復(fù)上述操作,取兩次的平均值為最終的GPSEP 潛伏期(如遇波形不顯著或雜波較多干擾判斷的應(yīng)則不予納入,繼續(xù)上述操作1～2 次,直至引出波形顯著而穩(wěn)定 的反應(yīng)后予以疊加)。

(2)比格犬陰莖背神經(jīng)體感誘發(fā)電位(DNSEP)檢測(cè)：陰莖體部以環(huán)狀電極置于陰莖體的前部及根部,作為刺激電極;接地電極、記錄電極位置及各參數(shù)設(shè)定與GPSEP 相同;其余操作與GPSEP 檢測(cè)大致相同(見(jiàn)圖1)。

1.3.3 比格犬陰莖背神經(jīng)切除及術(shù)中PSEP 監(jiān)測(cè)方法

(1)術(shù)前調(diào)試顯微鏡;麻醉成功后,測(cè)定全麻下PSEP 后。 取比格犬陰莖陰囊部“U”形切口,逐層切開(kāi)皮膚、皮下組織,游離自陰莖頭部至陰莖根部,將整個(gè)陰莖海綿體、尿道海綿體組織自比腹部皮膚附著處牽出。

(2)術(shù)中測(cè)量陰莖頭部陰莖骨的長(zhǎng)度(7 ～8 cm),打開(kāi)包繞陰莖海綿體及尿道海綿體的“BUCK氏”筋膜,充分游離陰莖背側(cè)的筋膜組織。

(3)顯微鏡下觀察陰莖背動(dòng)脈外側(cè)陰莖背神經(jīng)走向,在海綿體白膜表面找到犬陰莖背神經(jīng),顯微鏡下呈淺微黃色,以顯微鉗鑷將神經(jīng)及分支仔細(xì)游離,以細(xì)絲線牽引(見(jiàn)圖2)。 將滅菌后的環(huán)狀電極線置于比格犬陰莖部提供電刺激,腦部電極、接地電極位置同上節(jié)“全麻下測(cè)定”,檢測(cè)DNSEP;同法檢測(cè)GPSEP。 逐一切除游離的神經(jīng)5 ～10 mm 不等,送病檢。 在切除陰莖背神經(jīng)過(guò)程中, 即在全麻后、DPN 分支切除一半時(shí)、切除完成時(shí),實(shí)時(shí)測(cè)定比格犬陰莖體感誘發(fā)電位DNSEP 及DNSEP,記錄潛伏期(Lat)及波幅(Amp)參數(shù)值,直至僅保留一支神經(jīng)分支,4-0 可吸收縫線分層縫合,包扎。 在比格犬術(shù)前30 min 以及術(shù)后48 h 內(nèi)給予二代頭孢菌素抗感染治療。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有資料采用SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,重復(fù)測(cè)量的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析,以P＜0.05 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 全麻后比格犬各部位電極放置位置Figure 1 The position of electrodes in beagle dogs after general anesthesia

圖2 顯露陰莖背血管、游離陰莖背神經(jīng)Figure 2 Exposure of dorsal penile vessels and separation of the dorsal penile newe

2 結(jié)果

2.1 術(shù)中SEP 連續(xù)檢測(cè)波形及參數(shù)分析

全麻后比格犬PSEP 檢測(cè)中獲得了較滿意的檢測(cè)波形(見(jiàn)圖3)。 5 只比格犬全麻下GPSEP 平均潛伏期為(41.84±1.41) ms,平均波幅(1.56±0.26)μV;DNSEP 平均潛伏期為(33.32±0.82) ms,波幅平均(1.56±0.18) μV。 在陰莖背神經(jīng)切除過(guò)程中,5 例比格犬的DNSEP 及GPSEP 的潛伏期在手術(shù)結(jié)束后較手術(shù)開(kāi)始時(shí)均有不同程度的延長(zhǎng),且DNSEP及GPSEP 的平均潛伏期總體呈延長(zhǎng)態(tài)勢(shì)(見(jiàn)圖4),其中3 例DNSEP 潛伏期呈逐漸延長(zhǎng)態(tài)勢(shì),2 例DNSEP 潛伏期在術(shù)中出現(xiàn)稍縮短,1 例GPSEP 潛伏期在術(shù)中出現(xiàn)縮短。

數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示：術(shù)中連續(xù)檢測(cè)在不同神經(jīng)分支切除時(shí)間點(diǎn)比格犬DNSEP/GPSEP 潛伏期平均值之間的差異均具有顯著性(P 值分別為0.025, 0.004),而DNSEP/GPSEP 波幅平均值在差異均無(wú)顯著性(P 值分別為0.520, 0.310)。 連續(xù)檢測(cè)DNSEP、GPSEP 所得到的參數(shù)及統(tǒng)計(jì)結(jié)果(見(jiàn)表1)。

2.2 比格犬術(shù)后恢復(fù)情況及切除神經(jīng)病理

未發(fā)現(xiàn)術(shù)后比格犬陰莖皮膚感染、壞死,術(shù)后排尿正常,切口愈合良好。 所有手術(shù)中切除的比格犬陰莖背神經(jīng)行病理檢查,結(jié)果均證實(shí)為神經(jīng)組織(見(jiàn)圖5)。

圖3 比格犬陰莖背神經(jīng)切除手術(shù)進(jìn)行中DNSEP/GPSEP檢測(cè)波形圖Figure 3 Waveform of GPSEP/DNSEP during the resection of dorsal penile nerve in Beagle dogs

圖4 比格犬DNSEP/GPSEP 術(shù)中平均潛伏期變化趨勢(shì)Figure 4 Trends of changes of the intraoperative average latency of DNSEP/GPSEP in the Beagle dogs

表1 5 例比格犬在陰莖背神經(jīng)切除過(guò)程中DNSEP/GPSEP 各參數(shù)測(cè)量結(jié)果比較Table 1 Comparison of DNSEP/GPSEP measurements in 5 beagle dogs during penile dorsal nerve resection

圖5 比格犬陰莖背神經(jīng)組織的病理學(xué)改變(HE 染色)Figure 5 Histopathology of the dog dorsal penile nerve(HE staining)

3 討論

在原發(fā)性早泄的臨床及基礎(chǔ)研究中,建立良好的動(dòng)物模型至關(guān)重要。 近年來(lái),大鼠PE 模型已用于實(shí)驗(yàn)研究[6-7],但實(shí)驗(yàn)均需在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行,不能模擬人清醒狀態(tài)下的真實(shí)情況;盡管交配實(shí)驗(yàn)篩選PE 模型代表性較好,但所需樣本量大,實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)[8]。 因此,對(duì)PE 動(dòng)物模型的研究仍需不斷探索,我們了解到,比格犬是目前生命科學(xué)研究中國(guó)際公認(rèn)的專用實(shí)驗(yàn)犬,其陰莖發(fā)育良好,可用于泌尿生殖系統(tǒng)的臨床研究[9-10]。 比格犬陰莖解剖結(jié)構(gòu)特殊,其具有成熟板層骨組織而無(wú)骨髓腔的陰莖骨(疲軟時(shí)起到支撐、承載作用,交配時(shí)能起到有力的向前推動(dòng)作用);但這并不影響其成為較好的神經(jīng)電生理檢測(cè)模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;有研究發(fā)現(xiàn)比格犬陰莖內(nèi)具有較多厚壁血管及交感神經(jīng)叢,并且陰莖海綿體內(nèi)有較多脂肪細(xì)胞[11];趙永斌等[12]的研究也發(fā)現(xiàn)比格犬陰莖血管、神經(jīng)與人陰莖存在一定相似性,是進(jìn)行男科學(xué)相關(guān)研究理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。 這些解剖學(xué)特點(diǎn)為基于陰莖神經(jīng)電生理的PE 神經(jīng)電生理機(jī)制的研究提供了重要的依據(jù)。 同時(shí),鑒于本研究的目的是基于PE 神經(jīng)電生理機(jī)制的探討,盡管未進(jìn)行交配實(shí)驗(yàn)篩選比格犬早泄模型,但并不影響全麻下陰莖背神經(jīng)切除術(shù)中陰莖神經(jīng)電生理檢測(cè)動(dòng)物模型的建立。

近來(lái)年,電生理學(xué)動(dòng)物模型的研究報(bào)道較多[13-14]。 任仙等[15]以成年比格犬作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象成功地建立了術(shù)中神經(jīng)電生理監(jiān)測(cè)動(dòng)物模型,為臨床選擇合適的運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位監(jiān)測(cè)參數(shù)提供了重要的參考,為本課題的設(shè)計(jì)與開(kāi)展提供了重要的參考依據(jù)。 本研究中在全麻下給予比格犬陰莖體部及陰莖頭部合適強(qiáng)度與頻率的電刺激,應(yīng)用針式電極在適當(dāng)腦區(qū)能夠記錄到穩(wěn)定的DNSEP 及GPSEP 波形;表明了應(yīng)用本研究中介紹的方法可以成功建立全麻下比格犬陰莖神經(jīng)電生理(主要為陰莖體感誘發(fā)電位)檢測(cè)模型。

由于臨床常規(guī)SEP 檢測(cè)的電刺激強(qiáng)度需要興奮周?chē)窠?jīng)中直徑較粗的有髓纖維,但刺激強(qiáng)度必須足夠大才能使所有粗大的有髓感覺(jué)軸突興奮,但過(guò)強(qiáng)刺激又會(huì)產(chǎn)生較大的偽跡[16],因此,本實(shí)驗(yàn)中在保證安全的前提下,經(jīng)反復(fù)測(cè)試發(fā)現(xiàn)在15 mA 電刺激強(qiáng)度時(shí)SEP 波形較穩(wěn)定,認(rèn)為15 mA 電刺激強(qiáng)度是比格犬全麻下進(jìn)行PSEP 檢測(cè)較合適的強(qiáng)度。研究還發(fā)現(xiàn)：GPSEP/DNSEP 的波形與人相似,DNSEP 的P40 潛伏期明顯短于正常人的潛伏期,在全麻下未切除神經(jīng)前測(cè)定的DNSEP 個(gè)別甚至接近30 ms 的位置,可能與比格犬的身長(zhǎng)較短有關(guān);但比格犬GPSEP 的潛伏期明顯長(zhǎng)于DNSEP,考慮盡管比格犬身長(zhǎng)較短,但因具有陰莖骨這一特殊的解剖結(jié)構(gòu)可能對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)存在一定的影響,故綜合以上兩種因素,使比格犬GPSEP 潛伏期變長(zhǎng),與正常人相當(dāng)[17]。

此外,SEP 主要反映脊髓后索即脊髓感覺(jué)通路的功能狀態(tài),是目前臨床上較為成熟的術(shù)中監(jiān)測(cè)項(xiàng)目之一[18-19]。 本研究顯示：在進(jìn)行陰莖背神經(jīng)切除過(guò)程中,GPSEP/DNSEP 潛伏期存在一定的變化,隨著切除陰莖背神經(jīng)分支數(shù)目的增多,多數(shù)存在潛伏期的進(jìn)行性延長(zhǎng),但波幅變化并不顯著,分析潛伏期變化原因認(rèn)為：術(shù)中切除陰莖背神經(jīng)分支發(fā)生以SEP 為主的神經(jīng)電生理結(jié)果變化的機(jī)制顯然與脊椎手術(shù)中脊髓缺血、損傷產(chǎn)生的SEP 變化的機(jī)制不同[20],可能為陰莖背神經(jīng)切除后影響了陰莖背神經(jīng)及分支傳導(dǎo)感覺(jué)的整體速度,然而具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

需要指出的是：在研究中SEP 波形常常受到一定程度的干擾,需要多次檢測(cè),考慮原因在于：SEP整個(gè)傳導(dǎo)通路從外周神經(jīng),通過(guò)脊髓,最終到達(dá)大腦皮質(zhì),結(jié)果易受到傳導(dǎo)過(guò)程中干擾因素的影響,包括電極直接接觸刺激的海綿體表面組織與接觸皮膚的情況存在差異,以及實(shí)驗(yàn)室環(huán)境、儀器、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身的生理因素等,故各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果可能難以比較,但這并不妨礙同一實(shí)驗(yàn)動(dòng)物自身的前后對(duì)照。 同時(shí),由于本研究中樣本數(shù)有限,需要更大樣本數(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 綜上所述,本研究成功地建立了比格犬陰莖背神經(jīng)切除術(shù)中神經(jīng)電生理檢測(cè)模型,表明在全麻下能夠誘發(fā)出穩(wěn)定的、可重復(fù)的PSEP 波形,在SDN 術(shù)中可連續(xù)檢測(cè)術(shù)中PSEP,其潛伏期隨手術(shù)進(jìn)行可能發(fā)生變化,研究結(jié)果有望為相關(guān)研究提供重要的參考。