楊 寧,李鴻雁,吳常青,李 非

(1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院,普通外科,北京 100053;2.北京大學第一醫(yī)院密云醫(yī)院,心胸血管外科,北京 101500)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全球第三大常見癌癥,第四大致死癌癥(僅次于肺癌、肝癌和胃癌)。 2015 年我國結(jié)直腸癌的新發(fā)病例數(shù)為37.63 萬人,因結(jié)直腸癌死亡患者19.10 萬人[1]。早期CRC 的5 年生存率為90%,進展期的CRC 則低至14%[2],及早發(fā)現(xiàn)疾病是降低死亡率的關鍵。

目前對CRC 的篩查基于糞便的試驗有糞便潛血試驗(FOBT)、糞便免疫化學試驗(FIT)及多靶點糞便-脫氧核糖核酸(FIT-DNA),但對糞便的厭惡造成該類試驗篩查率低。 結(jié)腸鏡檢查具有侵襲性,偶爾伴有嚴重的并發(fā)癥[3]。 癌胚抗原(CEA)和糖類抗原199 (CA199)表現(xiàn)不佳,而不作為CRC 早期檢測的標志物[4]。

循環(huán)游離的脫氧核糖核酸(DNA)作為癌癥血液標志物近年來備受關注。 而其中的SEPTIN9 基因因其在結(jié)直腸癌病變早期高度甲基化使得其成為結(jié)直腸癌早期診斷、治療及判斷預后的潛在標志物,目前已成為該領域研究熱點。 本文將對外周血SEPTIN9 及與結(jié)直腸癌相關研究及其進展進行綜述。

1 SEPTIN9 基因和mSEPT9

1.1 SEPTIN9 基因

SEPTIN 基因家族共有14 個成員(SEPT1 ～SEPT14)組成,由Scott 等[5]于1971 年在釀酒酵母中篩選溫度敏感性突變基因過程中發(fā)現(xiàn)。 SEPTIN9基因?qū)儆谄浼易逯械囊粏T,廣泛于除植物以外的所有真核細胞中,位于染色體17q25.3,長約24×104bp,含有17 個外顯子,有18 種不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和編碼15 個多肽。 其5’端產(chǎn)生6 個不同的mRNA 變異剪接體(即SEPTIN9-v1、v2、v3、v4、v4?和v5),而3’端的可產(chǎn)生3 種不同信使mRNA (即SV1、SV2和SV3)[6]。

1.2 SEPTIN9 甲基化與CRC 發(fā)生發(fā)展

SEPTIN9 基因編碼SEPTIN9 蛋白,該蛋白在細胞代謝中發(fā)揮著重要的生理作用。 研究發(fā)現(xiàn)SEPTIN9 蛋白能夠調(diào)節(jié)細胞生長,防止細胞分裂過快或以不受控制的方式進行分裂增殖,具有相應的抑癌作用[7]。

DNA 甲基化即甲基加到胞嘧啶或腺嘌呤核苷酸,主要發(fā)生在-胞嘧啶-磷酸酯-腺嘌呤-(-CpG-)位點,是正常發(fā)育過程中的表觀遺傳現(xiàn)象,對胚胎發(fā)育和體細胞分裂都是至關重要的,且通常以很高的保真度傳遞給子細胞。 已有研究表明[8],哺乳動物中有60%～90%的CpG 是甲基化的,未甲基化的CpG 通常以團簇形式存在,稱為CpG 島。 CpG 島通常存在于許多基因的50 個調(diào)控區(qū)域,尤其是啟動子區(qū)域。 當甲基化發(fā)生在CpG 島時,啟動子區(qū)域高水平的5-甲基胞嘧啶基因在轉(zhuǎn)錄上是沉默的,阻礙SEPTIN9 蛋白表達,從而促進CRC 發(fā)生發(fā)展。

1.3 入血方式及其節(jié)律

Mandel 和Metais 于1948 年首次于外周血中發(fā)現(xiàn)游離基因片段(cfDNA),mSEPT9 作為cfDNA 的一種,近年來被廣泛研究。 其入血方式有多種理論,其中“腫瘤細胞的主動釋放和壞死”占主流地位。 研究表明,mSEPT9 是從腫瘤細胞中被積極釋放到血液循環(huán)中的,它可以通過類似轉(zhuǎn)染的機制促進易感細胞向癌細胞轉(zhuǎn)化,這種現(xiàn)象目前被稱為“基因轉(zhuǎn)移”理論[9]。 同時,相比于凋亡所產(chǎn)生的180 bp 或更短的cfDNA,在癌癥患者外周血中發(fā)現(xiàn)的大于250 bp 的mSEPT9 更符合壞死所釋放的cfDNA[10],這表明壞死可能是外周血mSEPT9 的主要來源。 壞死的主要原因可能是腫瘤的生長過快超出了血液供應。

哺乳動物的晝夜節(jié)律是由下丘腦視交叉上核控制的,它調(diào)節(jié)代謝穩(wěn)態(tài)、免疫反應、細胞增殖及凋亡、DNA 損傷反應和腫瘤抑制等多種機制[11]。Toóth 等[12]研究表明外周血mSEPT9 水平在CRC患者的樣本中存在微弱的晝夜節(jié)律性。 mSEPT9 濃度最高時為午夜平均(31.99±31.33)ng/mL,最低時為下午6 時平均(27.05±16.97)ng/mL。 該研究同時發(fā)現(xiàn)在mSEPT9 濃度較低的情況下,日間活動可影響mSEPT9 檢測結(jié)果,因此可以通過在早晨早些時候收集樣本來提高篩選靈敏度。 然而Toóth 研究的樣本數(shù)量過少,這種節(jié)律性的存在與否需要更多的實驗研究來證實。

2 mSEPT9 試驗

DNA 甲基化的檢測方法很多,根據(jù)樣本預處理不同大體可以分為三種類型,分別為消化酶法、親和富集法及重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法。 目前CRC 患者外周血mSEPT9 檢測的方法(mSEPT9 試驗)主要是重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化法。 mSEPT9 試驗即應用某種試劑盒檢測外周血SEPTIN9 基因V2 區(qū)胞嘧啶甲基化程度。 該試驗是在2008 年開發(fā)的,最初用于不符合結(jié)腸鏡檢查患者早期CRC 檢測,后經(jīng)不斷改進,于2016 年美國FDA 批準用于50～75 歲的平均風險人群的篩查。

2.1 試劑盒

表觀基因組學公司于2008 年首次研究了外周血mSEPT9 檢測癌癥的性能并隨之推出第一代Epi proColon 試劑盒(Epi proColon 1.0)。 Church 等[13]大型前瞻性研究報道,Epi proColon 1.0 檢出CRC患者敏感性I 期為35%,II 期63%,III 期46%,IV 期77.4%,總體特異性為91.4%。 Nian 等[14]對25 項研究的meta 分析中指出Epi proColon 1.0 試驗的總體敏感性為71%,總體特異性為92%。 可以看出,第一代Epi proColon 在CRC 篩查方面已經(jīng)表現(xiàn)出很高的敏感性。

目前,第二代檢測試劑盒Epi proColon 2.0 已經(jīng)上市。 與第一代Epi proColon 試驗相比,第二代檢測方法在提高效率的同時,達到了更高的敏感性和特異性。 Wang 等[15]指出應用Epi proColon 2.0 后,檢測靈敏度從48.2%～73.3%提高到約71.00%～95.6%,特異性從80.0%～91.5%提高到84.8%～98.9%。 根據(jù)Potter 等[16]的報告,Epi proColon 2.0可以檢測低至7.8 pg/mL 的甲基化SEPTIN9。

此外,新興的senicolon 檢測法同樣具有較好性能。 Wu 等[17]的RESEP 機會性篩查研究中表明,senicolon 檢測法的結(jié)直腸癌的檢出率為76.6%,特異性為95.9%。 且該種檢測方法具有更優(yōu)化的技術、更便捷的操作和更低的成本,與商業(yè)化的mSEPT9 檢測方法Epi proColon 2.0 相比,其性能沒有差異。 然而該方法需要更多的臨床試驗數(shù)據(jù)加以證實。

2.2 算法及選擇

由于mSEPT9 試驗是在未甲基化cfDNA 的大背景下檢測微量的mSEPT9 而設計的,所以大多數(shù)研究都進行了多次聚合酶鏈式反應(PCR)以增強檢測敏感性。 mSET9 試驗的算法規(guī)定在這m 次PCR 重復實驗中至少需要出現(xiàn)n 次陽性,才可以判定為此次試驗陽性,該規(guī)定計作n/m 算法(n≤m)。常用的有1/1、1/2、1/3 和2/3 四種算法,1/1 算法為1 次PCR 重復實驗中要求出現(xiàn)1 個陽性,則判斷樣品為陽性;1/2 算法為2 次PCR 重復實驗中要求至少出現(xiàn)1 次陽性,則判斷樣品為陽性;1/3 算法為3 次PCR 重復試驗中要求至少出現(xiàn)1 次陽性,則判斷樣品為陽性;2/3 算法為3 次PCR 重復試驗中要求至少出現(xiàn)2 次陽性,則判斷樣品為陽性。

在使用多種算法的研究中可以觀察到不同的算法擁有不同的檢測性能。 Song 等[18]對19 項相關研究不同算法的靈敏度和特異性進行了分析比較,結(jié)果顯示,1/3 算法的敏感性(0.80)顯著高于其他所有算法,特異性(0.85)顯著低于其他所有算法,而2/3 算法的特異性最高(0.95)。 2/3 和1/1 算法的敏感性和特異性非常相似(敏感性：0.74 vs 0.73,特異性：0.95 vs 0.93)。 1/2 算法靈敏度最低(0.59),特異性(0.91)可接受。 可以看出,2/3 算法的整體性能最好,而1/3 算法的感敏度最好。 1/3算法以較低的特異性為代價提供了最佳的敏感性,而2/3 算法在敏感性和特異性之間提供了最佳的平衡,這與Nian 等[14]研究結(jié)論一致。

算法的選擇應該基于研究的特定需求。 如果優(yōu)先級是排除健康的陰性患者,應該使用特異性較高的算法,此時推薦使用1/3 算法,但是,如果優(yōu)先級是識別盡可能多的真正病人來提高疾病檢出率,如篩選試驗,應該使用敏感度最高的算法,此時推薦2/3 算法。

2014—2018 年國內(nèi)外關于mSEPT9 檢測結(jié)直腸癌不同試劑盒不同算法的敏感性和特異性檢驗結(jié)果,詳見表1。

表1 mSEPT9 檢測結(jié)直腸癌的敏感性和特異性結(jié)果Table 1 Sensitivity and specificity of mSEPT9 in colorectal cancer detection

2.3 試驗敏感性與臨床病理參數(shù)的關系

mSEPT9 試驗敏感性主要取決于外周血SEPTIN9 水平,而外周血SEPTIN9 主要來源于腫瘤細胞的釋放,不同分期的腫瘤,其腫瘤大小,浸潤程度,分化程度均大有不同,因此其外周血SEPTIN9水平也有顯著差異。 He 等[19]對其進行了多中心的系統(tǒng)性研究,結(jié)果表明早期CRC(0 期和1 期)的敏感性明顯低于晚期CRC(II、III 和IV 期)。 Jin 等[20]和?rntoft 等[21]的研究結(jié)果也證實了此點。 Song等[22]研究發(fā)現(xiàn)血漿mSEPT9 水平與腫瘤最大直徑呈線性關系。 Fu 等[23]研究表明腫瘤大小為＞5 cm的CRC 患者mSEPT9 陽性率明顯高于腫瘤大小≤5 cm 的CRC 患者(77.3% vs 51.7%)。 He 等[19]研究中對不同浸潤程度的CRC 進行比較,結(jié)果顯示未觸及漿膜層的CRC 的mSEPT9 敏感性低于觸及或生長于漿膜層外的腫瘤。 分化程度越低mSEPT9 檢出率越高,Fu 等[23]研究同樣指出與組織學分級較低(1 級和2 級)的CRC 病例相比,組織學分級較高的3 級和4 級mSEPT9 陽性率較高,具有統(tǒng)計學意義(75.0% vs 51.5%)。

He 等[19]還進一步研究比較了CRC 常見腫瘤位置的敏感性,得出mSEPT9 在升結(jié)腸、橫結(jié)腸、降結(jié)腸、乙狀結(jié)腸、直腸的敏感性無差異,這與Song等[24]、Church 等[13]及Jin 等[20]研究結(jié)果一致。

3 mSEPT9 試驗在CRC 患者中的臨床應用

3.1 結(jié)直腸癌篩查及早期診斷

mSEPT9 試驗在人群篩查試驗中有很高的敏感性和特異性。 PRESEPT 研究[13]是迄今為止唯一對平均風險無癥狀人群進行的篩查研究。 該研究顯示mSEPT9 試驗檢測CRC 的總體敏感性為48.2%,總體特異性為91.5%。 Wu 等[17]的RESEPT 研究中,首次報道了針對中國人mSEPT9 試驗機會性篩查(有癥狀高危人群)結(jié)果。 該研究指出mSEPT9試驗的敏感性為76.6%,特異性為95.9%。 此外,在最近Song 等[25]一項機會性篩選研究中,mSEPT9試驗的敏感性為75.1%,特異性為95.1%。 可以看出,mSEPT9 試驗在CRC 人群篩查中表現(xiàn)出良好性能。

除人群篩查試驗外,多項臨床病例研究也表明,mSEPT9 是CRC 篩查的可靠生物標記物。 Wang等[15]2018 年對多項臨床病例研究進行meta 分析后指出,應用Epi proColon 2.0 檢測mSEPT9 的敏感度約為71.0%～95.6%,特異性約為84.8%～98.9%。Nian 等[14]2017 年的meta 分析(25 項研究)中指出應用Epi proColon 1.0 試驗的總體敏感性為71%,總體特異性為92%,Epi proColon 2.0 試驗的總體敏感性為76%,總體特異性為94%。 Sun 等[26]2018 年的meta 分析(29 項研究)報告的敏感性范圍在37%至96%之間,特異性約79%到99%,同時該meta 分析還利用受試者工作特征曲線下方面積(AUC)和診斷優(yōu)勢比(DOR)研究了總體測試性能以及病例間的緊密性和診斷效率,證實了甲基化SEPTIN9 無論在1/3 和2/3 算法中都是CRC 良好的腫瘤標志物。

雖然mSEPT9 試驗對CRC 的檢測具有足夠的敏感性和特異性,早期篩查診斷CRC 的能力更值得我們關注及檢驗。 對此,Song 等[24]一項meta 分析(19 項研究)將各階段的陽性檢出率(PDR)匯總分析,得出隨著臨床分期的增加,其檢出率呈上升趨勢,更重要的是,在目前的體外診斷方法中mSEPT9試驗早期CRC 檢出率相當高(I 期和II 期的檢出率分別為59.6%和85.7%)。 使用2/3 或1/1 算法進行mSEPT9 試驗檢測,分別檢測出大約50%的I 期CRC 和70%的II 期CRC,都代表早期CRC 的高PDR。 因此mSEPT9 試驗對早期CRC 篩查及診斷具有高度敏感性及特異性。

3.2 CRC 手術療效評價、預后預測及監(jiān)測復發(fā)

常規(guī)外科手術療效多以創(chuàng)傷程度、恢復速度及術后生存時間等方面加以評價,然而利用cfDNA 水平評價手術療效研究很少。 Song 等[22]首次研究了mSEPT9 試驗在CRC 手術療效評價的作用,結(jié)果顯示97.5%(117/120)的受試者術后1 d mSEPT9 水平明顯下降,且超過一半的患者外周血mSEPT9 下降到檢測不到的水平,術后7 d mSEPT9 水平進一步下降。 Fu 等[23]對19 例經(jīng)手術治療的結(jié)直腸癌患者術前和術后的mSEPT9 進行配對研究,結(jié)果顯示,16 例中有14 例(87.5%)mSEPT9 由術前陽性轉(zhuǎn)為術后陰性。 可見,血漿mSEPT9 水平與CRC 具有顯著負相關性。 手術療效越好,術后mSEPT9 水平越低,甚至轉(zhuǎn)為陰性。

另外有研究表明,mSEPT9 對CRC 的復發(fā)及轉(zhuǎn)移具有較好的提示作用。 Song 等[22]通過監(jiān)測mSEPT9 水平對120 名患者的預后預測及監(jiān)測復發(fā)能力進行了評價,結(jié)果顯示：mSEPT9 檢測陽性的患者死亡風險高于檢測陰性的患者(危險比[HR] =2.51;95%置信區(qū)間：1.03 ～6.12;p=0.036),表明mSEPT9 是手術治療后預后及復發(fā)、轉(zhuǎn)移的監(jiān)測指標,這與Fu 等[23]研究結(jié)果一致。 此外在Tham等[27]一項對150 名CRC 患者為期5 年的前瞻性隊列研究結(jié)果顯示,血清中SEPTIN9 的高甲基化水平是腫瘤復發(fā)和腫瘤特異性生存不良的獨立預測因子。 術后mSEPT9 狀態(tài)可能直接提示患者是否存在隱匿性腫瘤細胞,并預測術后疾病復發(fā)可能。

3.3 作為輔助分子參數(shù),參與TNM 分期

結(jié)腸鏡檢查和最新影像學對CRC 的準確分期是治療計劃和預后的基礎。 定期更新的UICC 和TNM 分級系統(tǒng)仍然是全球分級標準,僅僅根據(jù)放射學上確定的解剖程度來分期癌變病變,忽視了對實體腫瘤生物學行為和侵襲性的新認識,而且在準確性方面也有相當大的缺陷。 SEPTIN9 甲基化作為輔助分子分期參數(shù)表現(xiàn)突出,能夠以增量的方式區(qū)分病理性UICC 和TNM 分期,因此與已建立的TNM 系統(tǒng)相結(jié)合,能夠提高現(xiàn)有方案的效率[28]。

3.4 與其他標記物(或方法)對比及聯(lián)合應用

CEA 作為廣譜腫瘤標志物,對于胃腸道(尤其是結(jié)直腸癌)及其他臟器的腫瘤監(jiān)測具有一定提示作用, 但對腫瘤的早期診斷效果不佳。 但將mSEPT9 同CEA 聯(lián)合應用時則顯示出優(yōu)于二者單獨使用的效果。 Wu 等[17]研究結(jié)果表明,單獨使用mSEPT9 法的靈敏度為77.0%,CEA 則為41.3%,而mSEPT9+CEA 聯(lián)合法敏感性可達到86.4%。 所以與單獨使用mSEPT9 相比,更推薦mSEPT9+CEA 聯(lián)合方法作為CRC 患者的篩查。

大便潛血試驗作為消化系統(tǒng)疾病的常規(guī)檢查,其陽性結(jié)果表明存在急性或慢性消化道出血,常提示潰瘍,腫瘤等疾病的存在。 但其對疾病的特異性極低。 雖不作為特異性篩查指標,但作為常規(guī)篩查選項,其陽性結(jié)果則同樣可增加mSEPT9 試驗的敏感性。 Xie 等[29]研究表明mSEPT9+FOBT 聯(lián)合法提高了CRC 篩查的敏感性,與單獨使用SEPTIN9 有顯著性差異(84.1% vs 61.8%)。 Johnson 等[30]及Wu等[17]同樣證實聯(lián)合應用的有效性。

糞便免疫化學試驗(FIT)是近年來新興的結(jié)腸癌篩查方法。 其通過免疫組化方法檢測糞便中的血紅蛋白,其結(jié)果較糞便潛血試驗具有更高的精確性。 關于FIT 與mSEPT9 試驗在結(jié)腸癌早期診斷中的敏感性比較,目前仍有較大爭議[20,26],但兩者聯(lián)合應用的敏感性明確高于二者的單獨應用[19-21]。

mSEPT9 作為新興的CRC 早期診斷標志物具有較高的特異性及敏感性,而聯(lián)合其他顯著性較高的標記物篩查CRC 則可獲得更好的效果。 但由于每個標記物的假陽性病例的積累,特異性可能會降低,因此,這些組合的特異性還需要進一步檢查。最佳組合可能是最能平衡敏感性和特異性的組合。

4 存在問題

mSEPT9 試驗雖然對CRC 疾病所有階段顯示出高敏感性和特異性,但目前檢查仍未實現(xiàn)全自動化,檢測過程仍需較多人工操作,成本較高。 由Ladabaum 等[31]進行的成本模擬分析顯示,與FOBT、FIT 和結(jié)腸鏡檢查等現(xiàn)有篩查策略相比,基于mSEPT9 的篩查方法并沒有節(jié)省成本。 但在群體水平上mSEPT9 能夠增加人群的參篩比例,在可接受的成本下可以讓CRC 患者獲得更多其它受益。

CRC 通常由腺瘤演變而來,非侵襲性腫瘤(腺瘤性息肉)的檢測是CRC 篩查計劃的重要組成部分。 早期發(fā)現(xiàn)這些癌前病變,能夠明顯降低CRC 的死亡率。 Nian 等[14]在2017 年發(fā)表的meta 分析結(jié)果顯示,mSEPT9 對腺瘤和息肉的檢測靈敏度分別為15%和5%,2018 年Fu 等[23]研究報道中指出腺瘤患者mSEPT9 陽性率明顯低于CRC (7.9% vs 61.2%),因此mSEPT9 對CRC 癌前病變的篩查仍有較大缺陷。

5 小結(jié)及未來展望

綜上所述,外周血甲基化SEPTIN9 與結(jié)直腸癌的發(fā)病機制密切相關,外周血中SEPTIN9 基因甲基化水平不僅可以用于結(jié)直腸癌的篩查及早期診斷,還可以用于CRC 手術療效評價及預后監(jiān)測。 但其具體效果評價仍需要更多的臨床評估。

在未來,破譯DNA 甲基化在內(nèi)的表觀遺傳信息,并將其應用于選擇合適的檢測方法和開發(fā)相應的治療方法,從而進一步優(yōu)化mSEPT9 檢測后,有可能改變結(jié)直腸癌的診斷和治療,提高預后。 同時如將mSEPT9 與已建立的TNM 系統(tǒng)相結(jié)合,將有助于CRC 的分子疾病分期,可能會提高現(xiàn)有方案的效率達到個性化治療。 近年來雖然酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向治療和程序性死亡-1/程序性死亡配體-1(PD-1/PD-L1)免疫治療已經(jīng)在腫瘤治療方面有了重大突破,但尚無任何治療與基因甲基化狀態(tài)相關。 基因甲基化相關治療的建立可能是癌癥治療的又一個巨大飛躍。