段懿涵,徐 健,盧學(xué)春,李樂斌,李瑞生,安麗萍?

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院藥分教研室,吉林 吉林 132013;2.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心,北京 100039)

糖尿病(DM)現(xiàn)已成為各國死亡率高的常見慢性疾病之一,主要原因是人們生活飲食不規(guī)律,少于運(yùn)動(dòng),引起機(jī)體糖代謝紊亂和體脂代謝失衡,導(dǎo)致體內(nèi)自由基大量產(chǎn)生,出現(xiàn)氧化應(yīng)激,脂質(zhì)膜過氧化等現(xiàn)象[1]。 進(jìn)而引發(fā)的高血糖現(xiàn)象也是致病的關(guān)鍵因素,DM 嚴(yán)重時(shí)還可傷及肝功能,腎功能和胰腺功能,出現(xiàn)各種疾病,因此在藥用真菌領(lǐng)域?qū)ふ姨烊唤笛撬幬锘蚴澄锸欠乐翁悄虿⊙芯康闹匾n題。 雞腿菇(Coprinus comatus)學(xué)名毛頭鬼傘,屬真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬[2]。 研究表明雞腿菇的營養(yǎng)價(jià)值很高,具有高蛋白、低脂肪、氨基酸種類齊全的特點(diǎn)[3]。 且含有大量的多糖,具有抗氧化[4],抗腫瘤[5],提高免疫力[6],抑菌[7]等生物活性,已被確定為符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)要求的集“天然、營養(yǎng)、保健”3 種功能合為一體的16 種珍稀食(藥)用真菌之一。 雖然目前已有關(guān)于以雞腿菇子實(shí)體為原材料的降血糖產(chǎn)品問世,但確切的降糖成分不明確,能否被提取純化后高效利用仍未見報(bào)道。 因此,本實(shí)驗(yàn)采用純化得到的CP 灌胃給予STZ 誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型,根據(jù)其檢測指標(biāo)和病理變化來探究其對糖尿病大鼠降血糖的有效作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選40 只雄性SPF 級(jí)Wistar 大鼠,體質(zhì)量200 ～220 g,分為四組。 由長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供[SCXK(吉)-2016-0003],飼養(yǎng)于北華大學(xué)藥學(xué)院動(dòng)物房[SYXK(吉) 2017-0011]。 通過了本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查(倫理號(hào)IACUC-2018-004),實(shí)驗(yàn)過程遵循3R 原則給予了人道關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

雞腿菇(中國福建省寧德市、由北華大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)韓冬老師鑒定合格)。 大鼠胰島素酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(貨號(hào)：E-EL-R2466)、尿素氮測試盒(貨號(hào)：C013-2)、血肌酐測試盒(貨號(hào)：C011-3)、甘油三酯測試盒(中國南京建成生物研究所,貨號(hào)：A110-1)、總膽固醇測試盒(貨號(hào)：A111-1)、超氧化物歧化酶測試盒(中國南京建成生物研究所,貨號(hào);A001-3)、丙二醛測試盒(貨號(hào)：A003-1)均購于中國南京建成生物研究所。 Infinite 全自動(dòng)化酶標(biāo)儀(意大利TECNA),血糖儀(德國ACCUCHEK)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 雞腿菇多糖提取

取雞腿菇500 g,加入1000 mL 純凈水,在85℃水浴回流提取3 次,每次提取2 h 后,過濾取上清用70%乙醇進(jìn)行沉淀,測得雞腿菇多糖的純度為73.18%。 取部分上述多糖加入470 mg/mg 的木瓜蛋白酶,在pH=6,酶解溫度60℃下水浴酶解2 h 得到純化的雞腿菇多糖純度最佳值為86.02%。 備用。

1.3.2 大鼠糖尿病模型的建造

將適應(yīng)一周后的大鼠隨機(jī)抽取10 只作為空白組(蒸餾水)。 其余30 大鼠分別單次腹腔注射50 mg/kg STZ 溶液,5 d 后檢測大鼠空腹血糖值,90%造模成功(血糖值＞23.2 mmol/L)。 將造模成功的大鼠分為3 組：模型組(生理鹽水)、CP 給藥組(CP450 mg/kg,依據(jù)文獻(xiàn)[8-9]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,制定給藥劑量)和陽性藥物組(胰島素0.0945 U/100 g)。空白組、CP 給藥組、模型組采取灌胃方式給藥,陽性藥組采取皮下注射方式給藥,持續(xù)60 d,監(jiān)測血糖及體質(zhì)量,并觀察體態(tài)變化。

1.3.3 糖耐量的測定

大鼠給藥干預(yù)60 d,禁食10 h 后,一次性給予葡糖糖溶液(2.0 g/kg),于0 min、30 min、60 min、90 min、120 min 用血糖儀測定尾靜脈血液血糖值。

1.3.4 血糖、體質(zhì)量及其內(nèi)臟指數(shù)檢測

采血前大鼠禁食不禁水10 h,用血糖儀檢測大鼠尾靜脈血液即得空腹血糖值。 并準(zhǔn)確稱量大鼠體質(zhì)量(g)和剖解后大鼠完整肝、腎濕重(g),詳細(xì)記錄。 臟器指數(shù)(%)= 臟器濕重(g)/體重(g)×100%[10]。

1.3.5 生化指標(biāo)的測定

采用全自動(dòng)化酶標(biāo)儀檢測血清中胰島素(INS)、尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)的水平以及勻漿肝和腎組織中的超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)水平。

1.3.6 HE 染色法觀察病理學(xué)改變

腎及肝組織置于多聚甲醛固定24 h 后,脫水進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,制成標(biāo)本切片。 切片浸泡于二甲苯后60℃烘干,進(jìn)行HE 染色,顯微鏡下觀察,拍照[11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20. 0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 各組大鼠血清中INS、BUN、Scr、TG、TC,腎及肝組織中MDA 水平及SOD 活性均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s )表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用t 檢驗(yàn)。 以P＞0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠糖耐量的影響

每組大鼠不同時(shí)段血糖值顯示,空白組、給藥組及陽性藥組與模型組對比顯著較低,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。 其中模型組糖耐量相對較差,給藥組糖耐量接近陽性藥組(見圖1)。

2.2 各組大鼠空腹血糖、體質(zhì)量、內(nèi)臟指數(shù)的影響

與空白組相比,模型組大鼠出現(xiàn)尿量、進(jìn)食、血糖(P＜0.01)增多,體質(zhì)量(P＜0.01)減輕現(xiàn)象。 對內(nèi)臟重量指數(shù)進(jìn)行分析,腎與肝重量均減輕(P＜0.01)。與模型組相比,給藥組大鼠生活狀況有明顯改善(P＜0.01)。 腎與肝重量顯著增加(P＜0.05)(見表1)。

2.3 各組大鼠血清生化指標(biāo)的變化

與空白組相比,模型組血清中胰島素降低(P＜0.01),尿素氮,血肌酐,甘油三酯和總膽固醇的含量均顯著上升(P＜0.01),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 與模型組相比,給藥組血清中胰島素升高(P＜0.01),尿素氮,血肌酐,甘油三酯和總膽固醇的含量均顯著降低(P＜0.01),差距有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且近似于陽性藥組(見表2)。

圖1 雞腿菇多糖對大鼠糖耐量的影響(n=7)Figure 1 Effect of Coprinus polysaccharide on glucose tolerance in the rats

表1 空腹血糖、體質(zhì)量、內(nèi)臟指數(shù)測定結(jié)果(±s,n=7)Table 1 Fasting blood glucose, body weight, visceral indexes of the rats

表1 空腹血糖、體質(zhì)量、內(nèi)臟指數(shù)測定結(jié)果(±s,n=7)Table 1 Fasting blood glucose, body weight, visceral indexes of the rats

分組Groups血糖(mmol/L)Blood glucose體質(zhì)量(g)Body weight肝重(g)Liver weight肝指數(shù)(%)Liver index腎重(g)Kidney weight腎指數(shù)(%)Kidney index空白Control 6.40±1.07 518.75±39.1 16.67±2.09 3.20±0.17 2.84±0.40 0.54±0.04模型Model 27.20±5.92?? 223.00±39.2?? 8.56±1.61?? 3.87±0.48?? 2.28±0.34? 1.04±0.16??給藥Coprinus polysaccharide 21.27±2.72# 240.50±27.0 9.97±0.88# 4.18±0.42 2.67±0.24# 1.01±0.18陽性藥Insulin 21.38±4.13# 264.10±31.5# 10.87±0.66## 4.21±0.81 2.71±0.41# 1.13±0.15

表2 血清中胰島素、尿素氮、血肌酐及血脂測定結(jié)果(±s,n=7)Table 2 Serum insulin, urea nitrogen, creatinine, and blood lipid levels in the rats

表2 血清中胰島素、尿素氮、血肌酐及血脂測定結(jié)果(±s,n=7)Table 2 Serum insulin, urea nitrogen, creatinine, and blood lipid levels in the rats

分組Groups胰島素(mU/L)Insulin尿素氮(mmol/L)Urea nitrogen血肌酐(μmol/L)Serum creatinine甘油三酯(mmol/L)Triglyceride總膽固醇(mmol/L)Total cholesterol空白Control 7.84±1.54 9.31±0.16 56.12±0.38 1.29±0.31 5.59±0.43模型Model 3.96±1.11?? 16.54±0.17? 84.20±6.30?? 2.41±0.14?? 7.15±0.71??給藥Coprinus polysaccharide 7.72±2.04## 11.38±0.11# 61.51±5.82## 1.55±0.07## 6.38±0.32##陽性藥Insulin 7.74±0.83## 12.30±0.08## 64.20±5.94## 1.77±0.32## 6.78±0.29##

2.4 腎及肝生化指標(biāo)的檢測

與空白組大鼠肝和腎組織勻漿中氧化指標(biāo)相對比,模型組SOD 活力顯著降低(P ＜0.01),MDA含量升高(P＜0.01),均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,給藥組與模型組相比較,SOD 活力顯著升高(P＜0.01),MDA含量降低(P＜0.01),并與陽性藥組作用趨勢相近且具有顯著意義(見圖2、圖3)。

2.5 病理學(xué)變化

HE 染色顯示,與空白組相比,模型組大鼠的腎小球肥大,系膜區(qū)增寬等現(xiàn)象[12],且球內(nèi)細(xì)胞核數(shù)量明顯減少;給藥組與模型組對比,腎小球形狀規(guī)則,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞核數(shù)量近似于空白組和陽性對照組(見圖4,其中箭頭所指處為明顯改變現(xiàn)象)。而模型組大鼠肝可見多數(shù)肝細(xì)胞內(nèi)呈空泡狀(糖原遇水而被溶解),胞核腫大。 給藥組與模型組對比,空泡狀數(shù)量明顯減少,效果明顯改善。 且細(xì)胞形態(tài)近似于空白組與陽性對照組(見圖5,其中箭頭所指處為明顯改變現(xiàn)象)。

圖2 雞腿菇多糖對大鼠腎、肝SOD 活力影響activity in the rat kidney and liver

3 討論

圖3 雞腿菇多糖對大鼠腎、肝MDA 含量影響content in the rat kidney and liver

圖4 大鼠的腎病理改變Figure 4 Pathological changes of the rat kidney tissues

圖5 大鼠肝的病理改變Figure 5 Pathological changes of the rat liver tissues

目前糖尿病及其并發(fā)癥的相關(guān)研究備受人們關(guān)注,本文采取Wistar 大鼠禁食后在胰腺功能處于儲(chǔ)備狀態(tài)時(shí)快速注射STZ 自由基激活劑[13],使胰腺組織迅速工作,進(jìn)而加重胰腺細(xì)胞損傷引起胰島素分泌降低,糖代謝紊亂,進(jìn)而引發(fā)1 型糖尿病[14]。長時(shí)間的胰島素缺失引起機(jī)體內(nèi)葡萄糖不能被充分利用,進(jìn)而增加了體內(nèi)蛋白質(zhì)與脂肪的消耗。 糖尿病早期腎小球病變,濾過率降低,此時(shí)出現(xiàn)水分大量丟失,血液滲透壓升高[15],出現(xiàn)口渴,多飲多尿現(xiàn)象。 因此形成“三多一少”的典型癥狀,即血糖升高,多飲多食,體重下降[16]。 植物多糖具有多靶點(diǎn)、多途徑、多向性、無毒副作用的藥理特點(diǎn),在治療糖尿病時(shí),可在降血糖的同時(shí)防止其并發(fā)癥[17]。 因此,將植物多糖類成分開發(fā)為高效、低毒的降血糖藥物已成為藥物研發(fā)的主流趨勢[18]。 學(xué)者董文南調(diào)研國內(nèi)外植物多糖降血糖的研究發(fā)現(xiàn),植物多糖可通過保護(hù)胰島β 細(xì)胞,增加胰島細(xì)胞數(shù)量,促進(jìn)胰島素分泌或釋放,從而增加胰島素敏感性、改善胰島素抵抗及改善糖代謝,同時(shí),植物多糖對糖尿病腎病、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病病足具有一定的改善作用[19]。 本研究基于上述文獻(xiàn)報(bào)道及實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)中雞腿菇提取物CP 有效治療糖尿病大鼠的作用,進(jìn)一步考察CP 降血糖的作用機(jī)制及其對糖尿病并發(fā)癥的防治效果。 結(jié)果模型組大鼠在單次腹腔注射STZ 一段時(shí)間后,出現(xiàn)多飲多食、尿量增多、體重減輕顯現(xiàn)。 表明注射STZ 后胰島細(xì)胞受到損傷,繼發(fā)產(chǎn)生此癥狀,其中糖耐量實(shí)驗(yàn)是灌注葡萄糖后一段時(shí)間根據(jù)血糖值變化情況來推測胰島是否損傷及機(jī)體對血糖的調(diào)節(jié)能力,本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M與空白組對比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明注射STZ 后對胰島細(xì)胞造成損害[20]。 正是因?yàn)檫@些始動(dòng)因素會(huì)進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腎病、肝病等并發(fā)癥。 糖尿病腎病和肝病的發(fā)病機(jī)制盤根錯(cuò)節(jié),主要與氧化損傷、血糖升高、糖基化終產(chǎn)物的增加等多種因素相關(guān)[21-22],其中氧化損傷與糖代謝紊亂新形成惡性循環(huán),是引起糖尿病發(fā)生的重要原因。 因此,氧化應(yīng)激反應(yīng)在科研及臨床研究中備受關(guān)注。 SOD 屬于活性蛋白酶,可催化O2發(fā)生歧化反應(yīng),平衡體內(nèi)氧化反應(yīng)及抗氧化反應(yīng)。 MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷,因此可通過MDA 了解膜脂過氧化的程度,以檢測細(xì)胞損傷程度。 本實(shí)驗(yàn)選取這兩種指標(biāo)聯(lián)合檢測,結(jié)果SOD 活力提高,MDA 含量降低,可以反映出雞腿菇多糖能顯著改善糖尿病大鼠腎及肝的抗氧抗能力,減少損傷。 血肌酐和尿素氮作為評估腎功能的重要指標(biāo),在一定程度上也可反映腎小球?yàn)V過功能和腎功能的損害程度[23]。 主要表現(xiàn)為肌酐是肌酸的代謝物,由酶催化分解進(jìn)入血液再從尿液排出,不受飲食的影響,與肌肉總量相關(guān)[24]。 尿素氮是人體氨基酸在肝內(nèi)合成蛋白質(zhì)分解轉(zhuǎn)化為尿素和二氧化碳的含氮物質(zhì)。 排泄同樣由腎經(jīng)腎小球?yàn)V過,當(dāng)腎小球?yàn)V過功能下降時(shí),血液中的含氮物質(zhì)升高,血尿素氮濃度升高[15]。 DM 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵在于糖代謝的紊亂,病情加重時(shí)會(huì)引起肝細(xì)胞脂肪合成能力增加和(或)轉(zhuǎn)運(yùn)入血能力降低,從而導(dǎo)致脂類物質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)積聚,形成脂肪肝[25]。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示雞腿菇多糖對大鼠體內(nèi)血肌酐,尿素氮均具有顯著性改善效果,總膽固醇和甘油三酯水平降低,肝脂質(zhì)堆積減輕,再結(jié)合臟器指數(shù)的改善,可直接反應(yīng)出本實(shí)驗(yàn)藥物對腎及肝具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述,提純酶解后的雞腿菇多糖在一定程度上能改善糖尿病大鼠的血糖血脂水平,抑制氧化應(yīng)激損傷,改善肝腎功能及組織學(xué)病變,這也為今后研究治療糖尿病的藥物提供科研數(shù)據(jù),為雞腿菇多糖規(guī)?；a(chǎn)、利用和開發(fā)提供理論和實(shí)踐依據(jù)。