徐昊淼,劉朝陽(yáng),陳成順,蘇 鑫,許亞梅?

(1.中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院,北京 100853; 2.國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院,北京 100021; 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700)

白血病的治療手段主要以化療、造血干細(xì)胞移植及免疫治療為主。 急性白血病特征為復(fù)發(fā)和對(duì)治療的抵抗,當(dāng)用標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療法治療時(shí),60%～80%的患者將達(dá)到緩解但是大多數(shù)患者會(huì)復(fù)發(fā),一旦復(fù)發(fā),該疾病對(duì)重復(fù)治療更具抵抗力[1]。 反復(fù)化療能夠引起機(jī)體免疫抑制、增加肝腎損傷,使白血病患者生存質(zhì)量下降甚至導(dǎo)致死亡。 以長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)為依據(jù),課題組所在科室研制了以祛瘀化痰為功的復(fù)方浙貝顆粒,配合西醫(yī)臨床手段進(jìn)行治療。 復(fù)方浙貝顆?？膳c化療藥物聯(lián)合應(yīng)用以緩解白血病癥狀,減輕放化療毒性,增強(qiáng)化療藥物的敏感性,提高患者免疫功能、抑制細(xì)胞惡性增殖,誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化凋亡[2];但該方未能有效緩解白血病患者發(fā)熱、口舌生瘡、厭食等癥狀,故而在復(fù)方浙貝顆?；A(chǔ)上加一味黃芩,組建了浙貝黃芩湯,既能夠改善白血病患者“痰瘀互阻、熱毒夾濕”的臨床證候,又有助于控制感染,縮短抗生素使用時(shí)間,發(fā)揮了抗白血病及緩解炎癥反應(yīng)的作用,改善患者生存質(zhì)量。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)BALB/c nude 小鼠,雌性27 只,5 ～6 周齡,小鼠平均體重為(18±0.79)g,購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0006],飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房SPF層流柜中[SYXK(京)2013-0015]。 實(shí)驗(yàn)方案符合3R 原則并通過(guò)了北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(IACUC)審批(2017-39)。

1.1.2 細(xì)胞

小鼠白血病細(xì)胞M1 購(gòu)于上海素爾生物科技有限公司,常規(guī)培養(yǎng)并傳代。

1.2 主要試劑與儀器

浙貝黃芩湯水煎劑購(gòu)買于中國(guó)北京同仁堂(集團(tuán))有限公司,組成：浙貝母、黃芩、川芎、防己,并由北京同仁堂制備熬成中藥湯劑,每劑熬成中藥湯劑濃煎50 mL,分裝于15 mL 離心管中,于4℃冰箱中保存。

注射用鹽酸多柔比星(海正輝瑞制藥有限公司,H33021980)：用5 mL 無(wú)菌水溶解藥末,配制成1 mg/mL 的儲(chǔ)備液,避光保存于-20℃冰箱備用,實(shí)驗(yàn)臨用時(shí),用滅菌注射用水稀釋該儲(chǔ)備液至0.1 mg/mL。

RPMI-1640 培養(yǎng)基(北京利維寧生物科技有限公司);Gibco 胎牛血清(北京裕恒豐科技有限公司);青霉素和鏈霉素各100 U/mL(Sigma);Anti-Mouse CD117-APC、 Anti-Mouse CD33-PE-Cyanine7(ThremoFisher)。 Wip1(D47)Rabbit mAb #11901 一抗(Cell Signaling)PBS;TRIzol(美國(guó)Sigma 公司);50 mL 離心管、15 mL 離心管(美國(guó)Corning 公司);氯仿、無(wú)水乙醇(北京化工廠);PCR 耗材(北京希凱恩生物科技有限公司);DEPC 水(GenStar 公司);AMV Buffer、5×AMV Buffer、dNTP、RNA inhibitor、SYBR Premix Ex Taq(大連寶生物Takara 公司);β-actin、Wip1、P53 實(shí)時(shí)定量PCR 引物(北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司);Oligo DT(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司)。

臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)ThermoScientific,型號(hào)Sorvall Legend RT);CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus 公司);流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter 公司,型號(hào)EpicsXL);反轉(zhuǎn)錄儀(美國(guó)伯樂(lè),C1000);熒光定量PCR 儀(ABI7500 美國(guó)伯樂(lè));蛋白質(zhì)常規(guī)電泳系統(tǒng)電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、垂直電泳槽(美國(guó)伯樂(lè)Mini-PROTEAN Tetra)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞及動(dòng)物

白血病細(xì)胞M1 接種于含有20%胎牛血清的1640 培養(yǎng)基的10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿中,37℃、5% CO2飽和濕度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

小鼠飼養(yǎng)于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所屏障環(huán)境動(dòng)物房SPF 層流柜中,含復(fù)合維生素B 的標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、飲水、墊料及一切與鼠接觸的物品均經(jīng)滅菌處理。 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度約為25℃,相對(duì)濕度為40%～70%,每日光照時(shí)間為12 h,實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。

1.3.2 造模及分組

1.草魚養(yǎng)殖主要技術(shù)關(guān)鍵是投餌，也就是要掌握好投餌率，包括不同溶氧、不同天氣、不同水溫、不同生長(zhǎng)階段的投餌率。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠白血病細(xì)胞M1 濃度調(diào)整為8×106個(gè)/只,通過(guò)尾靜脈注射法構(gòu)建小鼠白血病模型[3]。 依據(jù)總體設(shè)計(jì)對(duì)該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行分組,造模成功后,將白血病模型動(dòng)物隨機(jī)分成四組,每組6 只,共24 只即：模型組、浙貝黃芩湯灌胃(中藥)組、鹽酸多柔比星腹腔注射(化療)組、浙貝黃芩湯灌胃+鹽酸多柔比星腹腔注射(聯(lián)合)組,另將3 只健康小鼠設(shè)為空白對(duì)照組。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方案

經(jīng)尾靜脈注射細(xì)胞10 d 后檢測(cè)動(dòng)物外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù),CD33+CD117+細(xì)胞比例以鑒定模型,造模成功后開始給藥。 模型組動(dòng)物灌胃等劑量蒸餾水;中藥組灌胃浙貝黃芩湯,化療組腹腔注射多柔比星,聯(lián)合組灌胃浙貝黃芩湯、腹腔注射多柔比星。

多柔比星藥劑量為1 mg/kg,隔日1 次,共7 次,為使化療藥效充分發(fā)揮,停藥后適應(yīng)性飼養(yǎng)一周觀察;浙貝黃芩湯的用藥劑量為臨床用藥的7 倍(7.58 g /kg),每日1 次,共21 次。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)觀察指標(biāo)

觀察小鼠的一般情況,檢測(cè)血常規(guī)。

于給藥后第30 天或動(dòng)物瀕死前處死取材,眼球取血收集動(dòng)物血液檢測(cè)Wip1 mRNA,觀察動(dòng)物肝脾的形態(tài),取脛骨、腓骨骨髓FCM 檢測(cè)骨髓中CD33+CD117+比例;取部分肝脾進(jìn)行Western blot 檢測(cè)WIP1 的蛋白表達(dá),余下部分進(jìn)行組織病理切片HE染色,觀察浸潤(rùn)灶。

實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)引物序列見表1。

表1 實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)引物序列Table 1 Real-time quantitative PCR detection of primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般情況

圖1 模型組、中藥組、化療組、聯(lián)合組的生存狀態(tài)Figure 1 The survival status of the mice in the Model group, CFSD group, Adr group and Adr+CFSD group

2.2 小鼠給藥干預(yù)后體重變化

圖2 各組小鼠生存曲線Figure 2 Survival curves of the mice in each group

第20 天時(shí),模型組、中藥組、化療組小鼠體重下降與空白組相比具有明顯差異;第20 天時(shí),除空白組外,各組小鼠體重均有下降,模型組體重最低,聯(lián)合組體重價(jià)下降趨勢(shì)最平緩。 聯(lián)合組與空白組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,治療組與模型組比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 見表2、圖3。

表2 各組小鼠體重變化(g,±s)Table 2 Changes in body weight of the mice in each group

表2 各組小鼠體重變化(g,±s)Table 2 Changes in body weight of the mice in each group

注：與空白組比較,?P＜0.05,??P＜0.01。Note. Compared with the normal group,?P＜0.05, ??P＜0.01.

組別Group n 干預(yù)前Before第1 天1st day第5 天5th day第10 天10th day第15 天15th day第20 天20th day空白組Normal 3 18.32±0.24 18.72±0.37 19.69±0.33 19.85±0.02 19.97±0.49 19.79±0.38模型組Model 6 17.83±1.30 18.63±0.65 18.68±0.60 18.51±1.03 17.33±1.07 14.50±1.17??中藥組CFSD 6 17.94±0.70 18.20±0.68 18.76±0.68 18.27±0.83 17.65±1.61 15.66±2.35??化療組Adr 6 18.19±0.54 18.24±0.98 19.20±0.99 18.18±0.89 16.72±1.84 15.11±3.65??聯(lián)合組Adr+CFSD 6 17.88±0.76 18.02±1.36 18.46±1.43 17.53±2.14 17.78±1.48 17.08±1.84 F 0.758 3.492 1.066 6.361 6.927 3.268 P 0.564 0.686 0.399 0.140 0.089 0.039

圖3 各組小鼠體重變化曲線Figure 3 Body weight curves of the mice in each group

2.3 小鼠干預(yù)前后全血細(xì)胞分析變化情況

與空白組相比,各組小鼠外周血白細(xì)胞明顯升高,與模型組相比,治療組小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量下降;與空白組相比,各組小鼠外周血血紅蛋白稍有降低,化療組外周血血紅蛋白含量明顯低于其他組;各組小鼠外周血血小板計(jì)數(shù)雖有變化,與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),見表3。

2.4 外周血涂片白血病細(xì)胞比例

除空白組外,各組小鼠外周血涂片中可見白血病細(xì)胞,與模型組比較,化療組及聯(lián)合組小鼠外周血白血病細(xì)胞比例顯著降低,中藥組與模型組、化療組與聯(lián)合組比較時(shí)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表4。

表3 小鼠全血細(xì)胞分析(±s)Table 3 Changes in whole blood cell analysis of the mice

表3 小鼠全血細(xì)胞分析(±s)Table 3 Changes in whole blood cell analysis of the mice

注：與模型組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group,?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109/L)WBC counts(×109/L)血紅蛋白含量(g/L)Hemoglobin content(g/L)血小板計(jì)數(shù)(×109/L)Platelet count(×109/L)空白組Normal 3 2.81±0.31 158.67±9.29 760.67±64.83模型組Model 6 9.33±2.20? 156.67±10.01 833.33±135.71中藥組CFSD 6 6.55±2.26?# 155.01±21.80 689.50±152.31化療組Adr 6 4.09±2.70??## 121.67±23.05## 874.33±399.36聯(lián)合組Adr+CFSD 6 6.67±2.04 141.20±8.04 1054.60±260.065 F 5.897 4.673 1.602 P 0.003 0.007 0.211

表4 小鼠外周血白血病細(xì)胞比例(±s,n=6,%)Table 4 Changes in the proportion of leukemia cells in peripheral blood of the mice

注：與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups白血病細(xì)胞Leukemia cells模型組Model 12.60±9.71中藥組CFSD 7.00±3.61化療組Adr 1.58±1.75##聯(lián)合組Adr+CFSD 2.75±1.67#F 8.574 P 0.036

2.5 CD33+CD117+細(xì)胞比例

與空白組相比,各組小鼠骨髓中C D33+CD117+表達(dá)量顯著增高;與模型組相比,治療組小鼠骨髓中CD33+CD117+表達(dá)量下降,模型組＞中藥組＞化療組＞聯(lián)合組,中藥組與化療組、中藥組與聯(lián)合組、化療組與聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

與模型中相比,各組小鼠外周血細(xì)胞中CD33+CD117+比例下降,模型組＞中藥組＞化療組＞聯(lián)合組,中藥組與化療組、中藥組與聯(lián)合組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表5、圖4。

2.6 小鼠脾稱重

與空白組相比,各組小鼠都有不同程度的脾大,中藥組小鼠脾重量最輕,聯(lián)合組次于中藥組,與化療組脾重量相當(dāng),模型組＞化療組＞聯(lián)合組＞中藥組,中藥組與化療組、中藥組與聯(lián)合組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01),見表6、圖5。

表5 小鼠骨髓及外周血中CD33+CD117+表達(dá)(±s,%)Table 5 Changes of CD33+CD117+ expression in bone marrow and peripheral blood of the mice

表5 小鼠骨髓及外周血中CD33+CD117+表達(dá)(±s,%)Table 5 Changes of CD33+CD117+ expression in bone marrow and peripheral blood of the mice

注：與空白組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group, ?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 骨髓Bone marrow外周血Peripheral blood空白組Normal 3 0.75±0.29 -模型組Model 6 47.75±11.76 18.89±2.52中藥組CFSD 6 40.14±11.62## 10.52±2.28##化療組Adr 6 26.43±4.09## 3.85±0.24##聯(lián)合組Adr+CFSD 6 15.36±5.58## 2.13±0.61##F 23.495 48.616 P 0.000 0.000

圖4 小鼠骨髓及血液中CD33 陽(yáng)性細(xì)胞Figure 4 CD33 positive cells in the blood of mice

小鼠肝稱重可見各組重量相當(dāng),各組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.7 小鼠肝脾形態(tài)變化

各組小鼠脾都有不同程度的腫大,除中藥組外,其余各組脾均可見壞死灶;鏡下視野可見小鼠脾中存在多核仁、瘤聚細(xì)胞形成的浸潤(rùn)灶組織,體積大,核大而圓,脾結(jié)構(gòu)被白血病細(xì)胞破壞。 模型組小鼠的脾中有大量彌漫性白血病細(xì)胞浸潤(rùn)灶,數(shù)量上明顯多于其他三組,一個(gè)400 倍視野最多可觀察到5～6 個(gè)白血病細(xì)胞。 中藥組及聯(lián)合組小鼠脾病理切片中,能夠觀測(cè)到的白血病細(xì)胞浸潤(rùn)灶較少,脾內(nèi)結(jié)構(gòu)基本完整,但依然可見有白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)。

鏡下可見各組小鼠的肝組織結(jié)構(gòu)被破壞,部分白血病細(xì)胞浸潤(rùn),各組小鼠肝表面可見白色浸潤(rùn)灶,模型組小鼠浸潤(rùn)灶數(shù)量較多,單純中藥組及聯(lián)合組小鼠肝較少,化療藥小鼠肝表面粗糙,考慮可能是由于化療藥物所致,聯(lián)合組小鼠未見嚴(yán)重的肝損傷,考慮可能與中藥的作用有關(guān)。 見圖6、圖7。

2.8 小鼠Wip1 mRNA 的表達(dá)水平

模型組較空白組骨髓Wip1 mRNA 顯著增加,治療組Wip1 mRNA 表達(dá)量較模型組顯著降低,聯(lián)合組的小鼠骨髓Wip1 mRNA 的表達(dá)最低,模型組＞化療組＞中藥組＞聯(lián)合組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。各組外周血中Wip1 mRNA 表達(dá)差異較小無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見表7、圖8。

表6 小鼠肝脾的重量(±s,g)Table 6 Weight of liver and spleen of the mice

表6 小鼠肝脾的重量(±s,g)Table 6 Weight of liver and spleen of the mice

注：與空白組比較,?P＜0.05,??P＜0.01;與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。Note. Compared with the normal group, ?P＜0.05, ??P＜0.01. Compared with the model group, #P＜0.05, ##P＜0.01.

組別Groups n 肝Liver脾Spleen空白組Normal 3 1.066190±0.034459 0.156837±0.009639模型組Model 6 1.167540±0.153007 0.255680±0.030474??中藥組CFSD 6 0.992438±0.041468 0.182473±0.007355##化療組Adr 6 1.059987±0.403035 0.218290±0.013861?#聯(lián)合組Adr+ CFSD 6 1.096196±0.192931 0.213370±0.008098?##F 0.553 15.035 P 0.700 0.002

圖5 各組小鼠脾稱重Figure 5 Comparison of the mouse spleen weight in each group

2.9 Western blot 結(jié)果

反復(fù)實(shí)驗(yàn)加大檢測(cè)蛋白劑量后,各組肝脾中WIP1 蛋白表達(dá)量仍無(wú)明顯變化,中藥組、化療組、聯(lián)合組與模型組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),WIP1 在白血病小鼠肝脾中的表達(dá)仍需進(jìn)一步研究,見表8、圖8。

圖7 各組小鼠脾的病理變化(HE 染色)Figure 7 Pathological changes of the mouse spleen in each group(HE staining)

表7 各組小鼠骨髓及血液中Wip1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量Table 7 Relative expression levels of Wip1 mRNA in bone marrow and blood of the mice in each group

表8 肝脾中WIP1 蛋白表達(dá)量Table 8 WIP1 protein expression in the mouse spleens and livers

圖8 小鼠肝脾中WIP1 蛋白量表達(dá)Figure 8 Expression of WIP1 protein in the mouse livers and spleens

3 討論

Wip1 由野生型P53 誘導(dǎo)[4-5],屬于2C 型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP2C 家族中的一員,是DNA損傷反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的重要調(diào)節(jié)因子,能夠參與造血功能調(diào)節(jié)。 Wip1 由催化結(jié)構(gòu)域N 端和非結(jié)構(gòu)化C 端組成[6],與PP2C 家族的其他成員不同的是,其靠近活性位點(diǎn)的催化結(jié)構(gòu)域中存在獨(dú)特的皮瓣亞結(jié)構(gòu)域,使得Wip1 能夠選擇性作用于其它磷酸酶[7-8]。 Wip1 既能夠直接作用于P53 的去磷酸化過(guò)程,使Ser15 位點(diǎn)失活,也能夠作用于p38 蛋白(Thr180) 蛋白激酶來(lái)抑制P38 通路下游的分子P53的活性[9-11]。 Wip1 基因的缺失或者失活能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展,多種實(shí)體瘤的發(fā)病都與Wip1 的過(guò)表達(dá)有關(guān)[12-13],在血液腫瘤中也存在Wip1 的過(guò)表達(dá)[14-15]。

中藥能夠緩解癌癥癥狀,減輕放化療毒性,提高患者生存質(zhì)量,延長(zhǎng)生存期,在多種惡性病的治療中均有應(yīng)用[16-22]。 本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用急性髓系白血病動(dòng)物模型,探索浙貝黃芩湯能否通過(guò)下調(diào)Wip1 的表達(dá)發(fā)揮抗白血病作用。 方中浙貝味苦性寒,歸肺、心經(jīng),功效化痰止咳,清熱散結(jié);黃芩,其味苦、性寒,歸肺、心、肝、膽、大腸經(jīng),具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血等功效;防己味苦、辛,性寒;歸膀胱、肺經(jīng),可祛風(fēng)勝濕;川芎,辛,溫,歸肝、膽、心包經(jīng),可活血行氣,祛風(fēng)止痛。 四藥相和發(fā)揮抗白血病作用,既能與白血病細(xì)胞抗衡,又有效的保護(hù)小鼠臟器的完整性;浙貝黃芩湯與化療藥各有優(yōu)勢(shì)又相輔相成,能夠有效減輕化療的副作用,一定程度上能夠提高小鼠生存質(zhì)量,且中藥、化療藥均能夠通過(guò)Wip1 通路發(fā)揮作用,下調(diào)Wip1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量。 由于白血病發(fā)展后期實(shí)驗(yàn)組小鼠狀況較差無(wú)法收集足夠的骨髓樣本分選細(xì)胞進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn),故實(shí)驗(yàn)改用肝脾組織進(jìn)行檢測(cè),小鼠的肝脾組織中雖有大量白血病細(xì)胞浸潤(rùn),但多次實(shí)驗(yàn)仍未檢測(cè)出WIP1 蛋白條帶,分析可能是由于Wip1 從基因到蛋白層面間存在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程[23-24],使基因表達(dá)與蛋白表達(dá)之間存在差異,因此我們?nèi)孕柽M(jìn)一步研究,為日后明確中藥復(fù)方浙貝黃芩湯如何發(fā)揮作用提供研究基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了浙貝黃芩湯能夠降低Wip1 在白血病基因中的表達(dá),一定程度上能夠緩解白血病癥狀、保護(hù)臟器完整性、提高化療有效率,但單純應(yīng)用浙貝黃芩湯對(duì)抗白血病效力較弱,需與化療藥結(jié)合才能更好的發(fā)揮抗白血病的作用。