夏 麟,王曉武,段維勛,俞世強

(空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科,西安 710032)

近年來,胸主動脈瘤(thoracic aortic aneurysm,TAA)以及TAA 進(jìn)展形成主動脈夾層(thoracic aortic dissection, TAD)的發(fā)病率顯著升高,已成為危害國人健康的重要醫(yī)療與社會問題[1]。 胸主動脈瘤/夾層(thoracic aortic aneurysm/dissection, TAAD)是遺傳(Marfan 綜合征、Loeys-Dietz 綜合征、Ehlers-Danlos綜合征、Turner 綜合征等)、高血壓、動脈粥樣硬化、吸煙等多種因素誘發(fā)主動脈壁組織穩(wěn)態(tài)失衡,管壁結(jié)構(gòu)完整性被破壞,在血壓應(yīng)力作用下導(dǎo)致主動脈壁組織變薄,逐步瘤樣擴(kuò)張性疾病,甚至各層之間出現(xiàn)裂隙,進(jìn)展為夾層破裂,從而引起短時間內(nèi)大出血,因此,如果不能及時診斷、治療TAAD,將會危及患者生命[1-3]。

目前,有許多基礎(chǔ)研究開始關(guān)注TAAD 的發(fā)病因素、遺傳特點以及診斷和治療,而安全、簡單、無創(chuàng)的TAAD 動物模型的診斷方法在實驗研究中具有非常重要的監(jiān)測及評估作用。 臨床上TAAD 的檢測方式主要包括CT 血管造影(CT angiography,CTA)和心血管超聲,CTA 作為TAAD 篩查的“金標(biāo)準(zhǔn)”已成為入院診療主動脈瘤的主流方式,但出于安全、經(jīng)濟(jì)等方面考量,CTA 并未廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)實驗。 超聲檢查則在小動物血管研究中凸顯出方便易行等諸多優(yōu)勢,然而心血管超聲是否能夠替代CTA 成為主動脈穩(wěn)態(tài)基礎(chǔ)研究的標(biāo)準(zhǔn)檢測方式尚無定論。

目前,文獻(xiàn)報道有四大類較為成熟的小動物主動脈瘤造模方法：基因突變模型(FBN1、TGFβR、SMAD3、ACTA2)[3-4]、外科手術(shù)模型(豬胰蛋白酶腔內(nèi)灌注[5-6],CaCl2浸潤血管外壁[7-8])、AngII 皮下泵注模型[9-10]以及β-氨基丙腈(BAPN)飲水誘導(dǎo)模型[11-12]。 前三類建模方法多數(shù)針對于腹主動脈瘤(abdominal aortic aneurysm, AAA),目前BAPN 飲水誘導(dǎo)是建立TAAD 動物模型的有效方法之一?；谠摻７椒ǖ幕A(chǔ)研究發(fā)展迅速[13-14],文獻(xiàn)報道和筆者經(jīng)驗顯示BAPN 誘導(dǎo)TAAD 成模率穩(wěn)定在75%以上[15]。 然而建模過程中TAAD診斷手段的安全性和有效性尚未進(jìn)行評估。 因此,本研究擬利用BAPN 飲水誘導(dǎo)C57BL/6 小鼠的TAAD 模型,通過小動物超聲動態(tài)觀察小鼠瘤體的發(fā)展變化并與Micro-CT 結(jié)果進(jìn)行比較,為評價小動物超聲檢測在TAAD 動物模型中的診斷價值提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

24 只SPF 級C57BL/6 雄性小鼠(8 ～10 g, 3 周齡)購于空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心[SCXK(軍)2017-0043]并在實驗動物中心SPF 區(qū)域[SYXK(陜)2019-001]繼續(xù)飼養(yǎng)至7 周齡。 所有動物實驗均符合美國國立衛(wèi)生院(National Institutes of Health,NIH)出版的《實驗動物保護(hù)和使用指南》【NIH 出版物,No. 8523,1996 修訂】,研究方法符合3R(減少,替代,優(yōu)化)原則并通過空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心福利與倫理委員會審查(20180306)。

1.2 主要試劑與儀器

β-氨基丙腈(批號：A3134,Sigma-Aldrich 公司);異氟烷(批號：H19980141,河北一品制藥股份有限公司);碘帕醇造影劑(批號：H20053388,上海博萊科信誼藥業(yè)有限責(zé)任公司);Vevo 2100 小動物超聲儀(加拿大VisualSonics 公司);Siemens Inveon小動物CT 機(jī)(德國Siemens 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 制備動物模型方法

24 只3 周齡雄性C57BL/6 小鼠,體重(9.15±1.57) g,隨機(jī)平均分為模型組和對照組。 模型組小鼠給予正常飲食和溶有BAPN 的飲用水(1 g/(kg·d))喂水4 周;對照組給予正常飲食和和正常飲水。動態(tài)監(jiān)測小鼠體重,并于造模結(jié)束時(第4 周)用Vevo 2100 小動物超聲儀檢測小鼠胸主動脈及左側(cè)頸總動脈。 實驗過程中所有死亡小鼠立即解剖,判斷是否因TAAD 破裂死亡,破裂死亡小鼠胸腔可見血凝塊。

1.3.2 Vevo 2100 小動物超聲儀檢測小鼠胸主動脈瘤

使用Vevo 2100 小動物超聲儀進(jìn)行胸主動脈瘤探測。 C57BL/6 小鼠經(jīng)異氟烷麻醉后胸腹部脫毛,在鼠板上的心電圖金屬電極上涂導(dǎo)電膏,將鼠仰臥位放置于鼠板中央,將鼠的口鼻置于連接麻醉儀的管道中,用膠布將鼠的四肢固定于四個金屬電極片上。 于小鼠的胸部涂上37℃預(yù)熱的耦合劑,將鼠板向操作者右側(cè)傾斜約30°,C57BL/6 小鼠選用MS400 探頭,將探頭與鼠身體長軸平行,并向操作者右側(cè)傾斜約30°,選擇Ao Arch 檢測模式,前后左右微調(diào)探頭,直到獲得清晰的右心室圖像,將圖像向鼠頭側(cè)緩慢移動,可見主動脈弓圖像,以同時看見無名動脈、左側(cè)頸總動脈及左側(cè)鎖骨下動脈為標(biāo)志。

1.3.3 Micro-CT 檢測小鼠主動脈夾層動脈瘤

C57BL/6 小鼠異氟烷麻醉后作胸部正中切口分離皮膚及皮下筋膜,于肋骨劍突穿透橫膈膜進(jìn)入胸腔,利用止血鉗牽拉胸腺及胸骨以暴露心臟及大血管。 選用27-gauge IV 型導(dǎo)管針于實驗鼠左心室預(yù)灌肝素化PBS(5 U/mL)10 mL,同時切開右心室或下腔靜脈以排出血液。 驅(qū)血完成后立刻灌注碘帕醇造影劑,當(dāng)觀察到冠狀動脈、肺動脈、腸及肝脈管系統(tǒng)充盈造影劑后停止灌注,使用Siemens Inveon小動物CT 機(jī)進(jìn)行主動脈掃描,并在多模態(tài)3 維可視化插件輔助下進(jìn)行血管重建。

1.3.4 小動物超聲儀檢測小鼠左側(cè)頸總動脈

采用傳播時間(TT)法估計脈搏波速(PWV)。其原理是超聲記錄兩個確定距離測量點之間脈搏波傳播時間進(jìn)而計算PWV,計算公式如下：PWV=近、遠(yuǎn)端測量點距離(D)/TT。 TT 計算方式如下：TT=遠(yuǎn)端時間延遲-近端時間延遲(遠(yuǎn)、近端時間延遲定義為遠(yuǎn)、近端測量點速率上升拐點與心電圖R 波波峰之間時間差)。 利用脈沖多普勒超聲可記錄在近端和遠(yuǎn)端兩個測量點實驗鼠心電圖,注意測量窗選取應(yīng)盡量在實驗鼠具有穩(wěn)定心率和呼吸時間段內(nèi)進(jìn)行。 因為超聲易于獲取左側(cè)頸總動脈(LCCA)矢狀位切面且LCCA 可提供主動脈弓與頸動脈分叉之間超過10 mm 的無分支血管通路,故選取實驗鼠LCCA 作為測量靶點。 D 測量則在B 超模式下進(jìn)行,近端測量點選取在主動脈弓向LCCA 下游約1 mm 處,遠(yuǎn)端測量點選取在LCCA 分叉處上游約1.5 mm 處。

TT 法測量使用VisualSonics Vevo 2100 小動物超聲儀。 B 超數(shù)據(jù)在頻率40 MHz,幀率30 fps 下獲取。 多普勒數(shù)據(jù)在頻率30 MHz,脈沖回復(fù)頻率50 kHz 下獲取。 ECG 信號使用心率探測系統(tǒng)記錄并在1 kHz 低通濾波器平滑處理后以8 kHz 頻率導(dǎo)入Vevo 2100 系統(tǒng)。 結(jié)果使用VisualSonics 分析軟件進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPadPrism 5.1 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。實驗數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組之間數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)差異分析采用Student t 檢驗方法,概率統(tǒng)計采用雙側(cè)檢驗,以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠體重變化

兩組小鼠造模第0 周體重?zé)o明顯差異(P =0.575);與對照組相比,造模第2 周模型組小鼠體重明顯降低(P＜0.01),造模第4 周,模型組小鼠體重仍然顯著低于對照組(P＜0.01)(表1)。

2.2 小動物超聲儀檢測小鼠TAAD

B 超和多普勒彩超影像顯示,對照組小鼠胸主動脈管徑大小均勻一致,胸主動脈最大內(nèi)徑為(1.056±0.141) mm;β-氨基丙腈模型組小鼠胸主動脈在主動脈弓處出現(xiàn)膨出瘤樣變化,胸主動脈最大內(nèi)徑到(2.118±0.338) mm,顯著高于對照組(圖1,表2)。

2.3 小動物超聲儀檢測小鼠左側(cè)頸總動脈

B 超和多普勒彩超影像數(shù)據(jù)顯示,對照組小鼠脈搏波速為(1.92±0.14) m/s,β-氨基丙腈模型組小鼠脈搏波速明顯增大到(3.91±0.35) m/s,顯著高于對照組(圖2,表2)。

2.4 Micro-CT 檢測小鼠胸主動脈瘤/夾層

Micro-CT 三維重建影像顯示,對照組小鼠胸主動脈管徑大小均勻一致,形態(tài)光滑連續(xù);β-氨基丙腈模型組小鼠胸主動脈出現(xiàn)局部膨大,明顯動脈瘤體形成(圖3)。

表1 C57BL/6 小鼠體重變化Table 1 Changes of body weight of the C57BL/6 mice(±s, n=12)

表1 C57BL/6 小鼠體重變化Table 1 Changes of body weight of the C57BL/6 mice(±s, n=12)

注：與對照組比較,??P＜0.01。Note. Compared with the control group, ??P＜0.01.

組別Groups給藥時間(weeks)Time after administration 0 2 4對照組體重(g)Body weight of Control group 9.06±1.66 16.11±2.31 19.50±2.77 β-氨基丙腈組體重(g)Body weight of BAPN group 9.24±1.54 12.45±1.76?? 16.33±1.08??

圖1 兩組小鼠主動脈弓超聲影像圖比較Figure 1 Comparison of the ultrasound images of the mouse aortic arch in each group

表2 C57BL/6 小鼠胸主動脈最大內(nèi)徑及脈搏波速比較Table 2 Comparison of the maximum aortic internal diameter and PWV in the C57BL/6 mice(±s, n=12)

表2 C57BL/6 小鼠胸主動脈最大內(nèi)徑及脈搏波速比較Table 2 Comparison of the maximum aortic internal diameter and PWV in the C57BL/6 mice(±s, n=12)

注：與對照組比較,??P＜0.01。Note. Compared with the control group, ??P＜0.01.

組別Groups胸主動脈最大內(nèi)徑(mm)Maximum aortic internal diameter脈搏波速(m/s)PWV對照組Control group 1.056±0.141 1.92±0.14 β-氨基丙腈組BAPN group 2.118±0.338?? 3.91±0.35??

3 討論

胸主動脈瘤/夾層是臨床最常見的一種血管病變,非常兇險,發(fā)病急,死亡率高,被稱為“奪命三明治”[16-18],及時準(zhǔn)確診斷TAAD 非常重要。 目前,臨床主要通過CTA 檢查和心血管超聲檢測診斷TAAD,鑒別TAAD 的類型。 其中,CTA 技術(shù)是明確診斷TAAD 最重要的方法,在診斷TAAD 時的特異性和敏感性均可達(dá)到100%。 超聲心動圖檢測是診斷急性主動脈夾層最簡單、有效的方法,但存在一定的假陰性和假陽性率,其敏感度是60%～80%,特異性是80%～96%[19]。

我們實驗室利用小動物超聲儀和Micro-CT 檢測小鼠TAAD,觀察小鼠胸主動血管內(nèi)徑的變化和脈搏波速變化。 通過對兩種檢測方法的比較,我們認(rèn)為利用小動物超聲儀檢測小鼠TAAD 具有一定的優(yōu)勢。

圖2 兩組小鼠左側(cè)頸總動脈超聲影像圖比較Figure 2 Comparison of the ultrasound images of the mouse left common carotid artery in each group

圖3 兩組小鼠胸主動脈Micro-CT 三維重建圖比較Figure 3 Comparison of the three-dimensional reconstruction images of the mouse thoracic aortas in each group by Micro-CT

首先,小動物超聲具有對動物無創(chuàng)傷、操作簡單、檢測需要時間短、成本低等優(yōu)勢。 通過小動物超聲儀檢測動態(tài)觀察小鼠胸主動脈,不僅可以及時剔除造模不理想的動物,減少實驗的盲目性;而且可以通過組間對照、自身對照動態(tài)評價藥物等處理因素對瘤體大小的作用,實現(xiàn)實驗的針對性;同時可以及時發(fā)現(xiàn)因瘤體過大而處于高危狀態(tài)的動物,在瘤體破裂之前提前處理,避免實驗的不可控性;另外,基于小動物超聲儀的使用普及增加,利用小動物超聲儀檢測主動脈瘤更加易于實現(xiàn)[15,20-21]。Micro-CT 也能檢測TAAD,與小動物超聲儀相比較,CT 檢測在TAAD 動物模型中的診斷中有以下不足：1)CT 檢測小鼠TAAD 需要注射造影劑,成本高,檢測時間長,且預(yù)灌造影劑通常需要處死動物;2)CT檢測無法實現(xiàn)動態(tài)觀察頸總動脈血管狀態(tài)和血流速度;3)CT 檢測不可避免存在射線污染;4)目前小動物CT 機(jī)普及范圍遠(yuǎn)不及小動物超聲儀[22]。

其次,小動物超聲儀能夠檢測頸總動脈并計算PWV[23],作為一種常用的主動脈功能學(xué)評價指標(biāo),小動物超聲儀能提供小鼠TAAD 造模過程中更為全面的質(zhì)量控制。

因此,小動物超聲檢測是一種簡單、快速、安全評價小鼠TAAD 模型的建立、動態(tài)變化的診斷方法,直觀、無創(chuàng)、用時短、成本低、準(zhǔn)確性高,值得在胸主動脈瘤/夾層等動物實驗研究中推廣應(yīng)用。