胡福清，陳雅祺，吳齊，胡俊波，王桂華，劉鷺

0 引言

自噬相關蛋白5（autophagy related protein5,ATG5）是一種重要的自噬小體形成相關蛋白，主要起類E1樣激活酶作用[1-2]。大量的文獻報道，除了發(fā)揮調控自噬的作用外，ATG5在病毒免疫、腫瘤凋亡和腫瘤增殖中也發(fā)揮了重要的作用[3-5]，有研究提示ATG5有望成為臨床腫瘤治療的新靶點[6]。然而ATG5與腫瘤細胞衰老的關系鮮有報道。

腫瘤最重要的生物學特點體現(xiàn)在腫瘤細胞倍增時間縮短，分裂能力增強，而造成這一特性的原因目前尚不清楚，因此臨床針對腫瘤靶向治療取得的效果亦有限，深入探討腫瘤發(fā)生發(fā)展的具體分子機制顯得尤為重要。腫瘤衰老目前被認為是一種抑制腫瘤增殖與分裂的重要方式，研究目前已認為其機制與p53/p21、p16/RB、細胞周期蛋白等信號通路密切相關[7-8]。針對腫瘤衰老機制深入的研究有望為腫瘤干預帶來新措施和新思路。因此本文將重點闡明ATG5與腫瘤衰老的關系，探討以ATG5為分子靶點作為治療腫瘤的可行性。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人結腸癌HT29細胞由華中科技大學附屬同濟醫(yī)院分子生物中心保種培養(yǎng)傳代。β-半苷乳糖檢測試劑盒以及CCK8檢測試劑盒（cell counting kit-8）購于江蘇碧云天生物公司，多柔比星（DOX，10 mmol/L）購于上海Med Chem Express（MCE）公司。轉染試劑Lipo2000和Opti-MEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司，針對ATG5特異性siRNA和對照無序小干擾RNA購于廣州銳博生物公司。ATG5、GAPDH、P53和P21抗體均購自美國Santa Cruz生物科技公司，高糖培養(yǎng)基購于武漢啟動子生物公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

結腸癌HT29細胞培養(yǎng)在含有5%CO2的37℃恒溫箱中，建立誘導結腸癌衰老模型時，使用1 μmol/L多柔比星于HT29細胞中孵育24 h。細胞傳代時，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞2 min，加入高糖培養(yǎng)基中和胰蛋白酶，將細胞輕柔吹打成單細胞懸液。

1.3 細胞轉染

將結腸癌HT29細胞鋪于6孔板中加入2 ml完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞貼壁，融合度達60%時進行轉染。分別將siRNA和Lipo2000溶于250 μl Opti-MEM培養(yǎng)基中，靜置5 min后將siRNA和Lipo2000輕柔混合再次靜置20 min。期間，棄6孔板中細胞培養(yǎng)基，加入1.5 ml完全培養(yǎng)基。20 min后，將siRNA和Lipo2000混懸液輕柔加入六孔板中，繼續(xù)放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.4 細胞衰老β-半乳糖苷酶染色

將細胞鋪于6孔板中進行相應實驗干預，通過多柔比星誘導細胞衰老或利用siRNA低表達ATG5后，棄細胞培養(yǎng)基，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫放置15～30 min。吸出固定液后用PBS洗滌細胞2～3次。每孔加入1 ml染色工作液后，將6孔板封口膠封閉置于不含CO2的37℃烘箱中孵育12 min。次日將6孔板取出，顯微鏡下觀察細胞著色情況并拍照。

1.5 CCK8法檢測細胞增殖

細胞轉染24 h后，將各組細胞鋪于96孔板，每孔約3 000個細胞，每組設置3個復孔。待細胞貼壁后，分別于0、24、48、72 h在每孔中加入10 μl CCK8，孵育2 h后，使用酶標儀檢測細胞在450 nm波長處吸光度，繪制各組細胞生長曲線。

1.6 Western blot檢測蛋白表達

將細胞鋪于6孔板中，通過多柔比星誘導細胞衰老或利用siRNA低表達ATG5后，將細胞置于冰上，細胞裂解液裂解30 min，刮取細胞置于1.5 ml EP管中，高速低溫離心（4℃，12 000 r/min）15 min，取上清液測蛋白濃度，計算樣品濃度及蛋白上樣量。加樣以SDS-PAGE膠電泳分離蛋白，濕轉至PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉。分別孵育一抗和二抗后，在Western blot曝光機下利用ECL發(fā)光顯色。

1.7 PI染色細胞周期實驗

將細胞鋪于6孔板中，通過多柔比星誘導細胞衰老或利用siRNA低表達ATG5后，胰酶消化收集細胞，低速離心（常溫，1 200 r/min），每管加入預冷的80%乙醇固定細胞。過夜，低速離心后，PBS洗滌細胞沉淀一次，加入200 μl binding buffer，同時分別加入5 μl PI和5 μl RNase，吹打均勻后室溫避光靜置30 min，流式細胞儀檢測各組細胞的細胞周期分布變化。

1.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，檢驗方法采用t檢驗。每組實驗均進行了三次獨立重復實驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ATG5蛋白在多柔比星誘導的結腸癌衰老模型中的表達

為檢測ATG5是否參與了結腸癌衰老的過程，在HT29細胞中加入1 μmol/L多柔比星培養(yǎng)48 h，細胞衰老現(xiàn)象顯著增加，見圖1A。相對于對照組，誘導組細胞增殖活性明顯下降，見圖1B。同時誘導組細胞發(fā)生G2/M期阻滯，見圖1C。證實多柔比星誘導結腸癌細胞衰老模型建立成功。另外收集細胞進行Western blot檢測ATG5蛋白表達量，發(fā)現(xiàn)相對于對照組，誘導組中ATG5蛋白的表達量顯著降低，提示ATG5蛋白可能參與了結腸癌細胞衰老過程，見圖1D。

圖1 ATG5在結腸癌衰老細胞中低表達Figure 1 ATG5 expression was downregulated in colon cancer cell senescence

2.2 ATG5對結腸癌細胞衰老的影響

在HT29細胞中瞬時轉染針對ATG5的siRNA（兩條靶向ATG5的不同siRNA序列：SiATG5#1和SiATG5#2）和對照siRNA（SiNC），24 h后，通過β-半乳糖苷酶染色檢測發(fā)現(xiàn)，siRNA對照組發(fā)生衰老細胞數(shù)平均值為3±1，而SiATG5組發(fā)生衰老細胞數(shù)平均值為11±2，見圖2A～B，提示低表達ATG5可促進HT29細胞衰老。由于ATG5是自噬調控蛋白，因此為了排除自噬在ATG5調控結腸癌細胞衰老中的作用，在低表達ATG5的同時加入自噬誘導劑Rapa（1 μmol/L）誘導自噬，24 h后SiNC對照組細胞發(fā)生衰老細胞數(shù)平均值為3±1，而SiATG5組發(fā)生衰老細胞數(shù)平均值為12±2，低表達ATG5+Rapa組發(fā)生衰老細胞平均值為12±1，見圖2C～D，提示ATG5對結腸癌細胞衰老的促進作用并非依賴于自噬。

2.3 ATG5對結腸癌細胞增殖的影響

在HT29細胞中瞬時轉染針對ATG5的siRNA和對照siRNA，預轉染24 h后，將細胞消化接種于96孔板。CCK8法檢測細胞增殖能力，結果發(fā)現(xiàn)在轉染48 h后相對于對照SiNC，SiATG5#1、SiATG5#2組細胞增殖能力明顯較弱（P＜0.05），見圖3A，提示ATG5通過調控細胞衰老來抑制HT29細胞的增殖。另外，在低表達ATG5的同時加入自噬誘導劑1 μmol Rapa誘導自噬，發(fā)現(xiàn)SiATG5#1組細胞和低表達ATG5+Rapa組之間細胞增殖活性無明顯差異，見圖3B。證實ATG5通過誘導衰老抑制結腸癌細胞HT29增殖非依賴于自噬。

圖2 低表達ATG5促進結腸癌細胞衰老Figure 2 Low expression of ATG5 promoted senescence of colon cancer cells

圖3 低表達ATG5抑制結腸癌細胞增殖Figure 3 Low expression of ATG5 inhibited proliferation of colon cancer cells

2.4 ATG5可調控P53和P21的蛋白表達

蛋白免疫印跡方法發(fā)現(xiàn)，SiATG5#1、SiATG5#2組中P53和P21蛋白表達較對照組明顯增高，見圖4。上述結果提示了ATG5很有可能通過P53/P21信號通路調控結腸癌細胞衰老進而影響腫瘤的增殖。

3 討論

結腸癌是目前世界上發(fā)病率和致死率均較高的惡性腫瘤之一[9-10]。雖然臨床手術技術的提高和靶向藥物的研發(fā)使得部分結直腸癌患者的預后得到改善，但總體預后仍不理想[11]。細胞的衰老行為在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著阻滯的作用，阻遏腫瘤的增殖能抑制腫瘤生長[12]。目前已知PI3K/AKT、TGFβ/SMADs、RAS、p53/p21等多種信號通路[8]的異常激活參與了腫瘤的衰老過程。

圖4 低表達ATG5可促進P53和P21蛋白的表達Figure 4 Low expression of ATG5 promoted expression of P53 and P21 proteins

ATG5作為自噬基因在自噬小體形成和自噬流過程中扮演了重要的角色并調控著腫瘤的多種生物學行為[13]。例如有學者報道下調ATG5通過抑制自噬促進乳腺癌的侵襲轉移[14]。多數(shù)研究均只關注ATG5通過調控自噬影響腫瘤的生物學行為，然而ATG5除了調控自噬作用外，是否有獨立于自噬的作用，目前尚無報道。同時ATG5在腫瘤衰老中的作用未見報道，腫瘤衰老過程中有大量的蛋白參與調控，相關蛋白的表達隨著衰老進程的變化而變化。本研究中首先發(fā)現(xiàn)了在腫瘤細胞衰老的過程中，ATG5蛋白表達水平明顯下降，提示ATG5可能參與了腫瘤衰老的過程。為了探討ATG5是否能夠調控腫瘤衰老，進一步通過特異性SiRNA構建了低表達ATG5的結腸癌細胞模型。通過β-半乳糖苷酶染色首次發(fā)現(xiàn)ATG5低表達確實可促進結腸癌細胞的衰老，CCK8實驗結果進一步揭示ATG5低表達可抑制結腸癌細胞增殖。這一結果提示ATG5很有可能通過調控結直腸癌細胞的衰老來影響腫瘤的增殖。以往的研究證實p21作為細胞周期抑制因子在腫瘤衰老中發(fā)揮了重要作用，而p53作為轉錄因子在轉錄水平激活p21的表達，進而引起細胞衰老，抑制腫瘤的增殖[15]。為了探索ATG5調控腫瘤衰老的分子機制，本研究通過Western blot實驗證實了低表達ATG5可以直接影響P53/P21信號通路的表達。同時進一步證實自噬水平升高后低表達ATG5仍可促進結腸癌細胞的衰老，這提示了自噬基因ATG5在結腸癌中發(fā)揮了非自噬作用，即：通過p53/p21信號通路調控結腸癌細胞衰老進而影響腫瘤的增殖。而在甲狀腺癌中有學者證實ATG5通過促進自噬抑制腫瘤的增殖[16]，提示在不同腫瘤中ATG5調控腫瘤增殖的具體方式各有不同，同時提醒我們ATG5調控腫瘤進展很有可能是通過影響衰老和自噬兩種水平方式來實現(xiàn)的。下一步課題組將集中探討ATG5在結腸癌中調控p53/p21的具體分子機制，以期望針對ATG5開發(fā)可用于臨床的特異性靶向藥物。