侯霞 ，周永安，田樹雄，李超，李敏，任蕊蕊，韓雅馨，程建萍，李星星，李哲，白園

0 引言

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤，嚴重威脅著全球女性的健康[1]。2019年的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，乳腺癌占女性新發(fā)腫瘤的30%，病死率為15%，與2018年的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)相比，乳腺癌仍位居女性新發(fā)腫瘤的第一位、腫瘤相關(guān)死亡原因第二位，且病死率呈上升趨勢[2-3]。因此，闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的病理生理學過程，不僅有利于篩選新的高靈敏度和高特異性生物學分子標志物，也有助于找尋新的分子治療靶點，從而達到控制乳腺癌發(fā)病率、降低乳腺癌死亡率的目的。

lncRNA XIST（X inactive specific transcript）即X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本，是長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）家族成員之一，位于X染色體失活中心[4]，是哺乳動物中X染色體失活的主要調(diào)節(jié)因子。最近的研究表明XIST在結(jié)直腸癌[5]、胃癌[6]、骨肉瘤[7]等許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，而且在不同腫瘤中其作用的分子機制有所不同，但是在乳腺癌中的作用尚未完全闡明。在前期研究中，我們通過文獻查閱發(fā)現(xiàn)XIST在乳腺癌組織和細胞系中的表達降低[8]，并利用qRT-PCR檢測了乳腺癌組織及癌旁正常組織中XIST的表達水平，發(fā)現(xiàn)XIST在乳腺癌組織中的表達水平明顯低于在癌旁正常組織中的表達水平，因此在本研究中我們首先通過qRTPCR檢測人乳腺正常上皮細胞以及乳腺癌細胞系中XIST的表達水平，并通過細胞實驗進一步檢測XIST對乳腺癌細胞功能的影響，盡可能揭示其中潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人乳腺癌細胞系MCF-7和正常乳腺上皮細胞MCF-10A購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。lncRNA XIST過表達質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)粒為本課題組構(gòu)建，miR-130b-3p Inhibitor和miRNA陰性對照購自上海吉瑪制藥有限公司。

RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基購自以色列BI公司，胎牛血清購自四季青公司，胰島素（INS）和表皮生長因子（EGF）購自加拿大Abm公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，TRIzol購自日本TaKaRa公司，InRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）、lnRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）、miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）購自天根生化科技有限公司，qRT-PCR所用特異性引物（表1）由上海生工生物工程股份有限公司合成，噻唑藍（MTT）和結(jié)晶紫購自索萊寶科技有限公司，Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) MCF-7細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，MCF-10A細胞用含5%胎牛血清、10 μg/ml INS、20 ng/ml EGF和500 ng/ml氫化可的松的DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)基中均添加適量青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液，使其終濃度為100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素和0.05 mg/ml的慶大霉素。MCF-7和MCF-10A細胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Sequence of qRT-PCR primers

1.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測 按照TRIzol說明書提取細胞總RNA；以2 μg總RNA為模板，按照InRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒（去基因組）和miRcute增強型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒分別進行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA產(chǎn)物保存在-20℃冰箱中；以相應cDNA為模板，按照lnRcute lncRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green）說明書進行qRT-PCR擴增檢測，其中l(wèi)ncRNA XIST檢測以GAPDH為內(nèi)參，miRNA檢測以U6為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt值計算相對表達量。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天取對數(shù)生長期的MCF-7細胞接種于6孔板中，細胞密度達60%～80%時按照Lipofectamine 2000說明書進行操作，將XIST過表達質(zhì)粒（XIST overexpression）及其陰性對照質(zhì)粒（Blank）或miR-130b-3p Inhibitor及miRNA陰性對照（Inhibitor N.C）分別轉(zhuǎn)入MCF-7細胞中，轉(zhuǎn)染過程中使用無血清、無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，qRTPCR檢測細胞中l(wèi)ncRNA XIST和miRNA的表達水平，進行后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染24 h的細胞消化、重懸，制備單細胞懸液，按每孔2 000個細胞接種于96孔板中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)4個復孔。分別在第1、2、3、4和5天檢測MCF-7細胞的增殖能力，具體操作如下：吸去舊培養(yǎng)基，每孔加入200 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)和20 μl MTT溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h；吸去上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶標儀在570 nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD）。

1.2.5 Transwell小室遷移實驗 將轉(zhuǎn)染24 h的細胞消化、重懸，用無血清的培養(yǎng)基制備單細胞懸液，細胞濃度為3×104個每毫升，Transwell小室的上室中加入200 μl細胞懸液，下室中加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每組設(shè)3個復孔。24 h后，用棉簽小心擦去上室中的細胞，將小室用PBS洗3次，然后用4%多聚甲醛固定液室溫固定20 min，用棉簽吸去上室中液體，0.1%結(jié)晶紫室溫避光染色10 min，流水沖洗小室，晾干水分后拍照并計數(shù)。

1.2.6 Transwell小室侵襲實驗 將預冷的Matrigel膠與無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基按1:9比例混勻，按每孔80 μl將膠均勻包被于Transwell小室底部膜內(nèi)，置于培養(yǎng)箱中使之成膠。其余步驟與細胞遷移實驗相同。

1.2.7 生物信息學預測XIST靶向的miRNA利用生物信息學數(shù)據(jù)庫（starBase V2.0）在線查找與XIST序列有潛在結(jié)合位點的miRNA。

1.3統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 XIST在乳腺癌細胞MCF-7中低表達

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，XIST在乳腺癌細胞MCF-7中的表達水平遠低于在乳腺正常上皮細胞MCF-10A中的表達水平，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖1。

2.2 XIST過表達可抑制MCF-7細胞的增殖能力

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Blank組相比，轉(zhuǎn)染XIST過表達質(zhì)粒后MCF-7細胞中XIST表達水平明顯提高，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001），見圖2。MTT法檢測結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，XIST過表達后MCF-7細胞的增殖能力明顯受到抑制，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），見圖3。

圖1 XIST在乳腺癌細胞MCF-7中低表達Figure 1 XIST expression in MCF-7 breast cancer cells was lower than that in MCF-10A normal breast epithelial cells

圖2 XIST轉(zhuǎn)染后XIST表達水平增加Figure 2 XIST transfection increased XIST expression in MCF-7 breast cancer cells

圖3 XIST過表達可抑制MCF-7細胞的增殖能力Figure 3 XIST overexpression inhibited proliferation of MCF-7 cells

2.3 XIST過表達可促進MCF-7細胞的遷移和侵襲能力

Transwell小室遷移和侵襲實驗結(jié)果顯示，與Blank組相比，XIST overexpression組細胞數(shù)量明顯增加，表明XIST過表達后MCF-7細胞的遷移和侵襲能力明顯增強（P=0.0024），見圖4。

2.4 XIST過表達可降低MCF-7細胞中miR-130b-3p的表達水平

圖4 XIST過表達可促進MCF-7細胞的遷移和侵襲能力 (×100)Figure 4 XIST overexpression promoted migration and invasion of MCF-7 cells (×100)

starBase V2.0預測結(jié)果表明與XIST有潛在結(jié)合的miRNA共有8個，分別為miR-130b-3p、miR-10b-5p、miR-92b-3p、miR-454-3p、miR-106a-5p、miR-20a-5p、miR-301a-3p和miR-106b-5p；根據(jù)qRT-PCR檢測結(jié)果篩選出2-ΔΔCt≥2或2-ΔΔCt≤0.5的miRNA作為本實驗確定差異表達的miRNA，同時查閱文獻尋找與XIST過表達對乳腺癌MCF-7細胞生物學進程影響一致的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p是唯一符合條件的miRNA，見表2。

表2 starBase V2.0預測與XIST有潛在結(jié)合的miRNATable 2 Binding sites of microRNA to XIST predicted by StarBase V2.0 software

miR-130b-3p序列以及與所研究的XIST序列按照堿基互補配對原則的結(jié)合位點見圖5A。qRT-PCR檢測結(jié)果表明，miR-130b-3p在乳腺癌MCF-7細胞中的表達水平明顯高于在乳腺正常上皮細胞MCF-10A中的表達，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001）；與Blank組相比，XIST過表達后MCF-7細胞中miR-130b-3p表達水平顯著降低（P=0.0068），見圖5B、5C。

2.5 miR-130b-3p低表達可增加MCF-7細胞中XIST的表達水平

圖5 XIST過表達可降低MCF-7細胞中miR-130b-3p的表達水平Figure 5 Overexpression of XIST reduced expression of microRNA-130b-3p in MCF-7 cells

qRT-PCR檢測結(jié)果表明，miR-130b-3p Inhibitor及Inhibitor N.C瞬時轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞后，與Inhibitor N.C組相比，miR-130b-3p Inhibitor組miR-130b-3p的表達水平明顯降低且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與Inhibitor N.C組相比，miR-130b-3p Inhibitor組細胞中XIST表達水平顯著增加（P＜0.001），見圖6。

圖6 miR-130b-3p低表達可增加MCF-7細胞中XIST的表達水平Figure 6 Low-expression of miR-130b-3p increased expression of XIST in MCF-7 cells

3 討論

隨著社會的發(fā)展，人們的生活方式、飲食習慣以及自然環(huán)境都發(fā)生著巨大的變化，乳腺癌發(fā)病人數(shù)逐年增加。乳腺癌不僅嚴重威脅患者的健康，還給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟負擔，而且乳腺癌治療帶來的乳房缺陷、脫發(fā)、皮膚顏色改變等各種身體改變會使患者產(chǎn)生明顯的羞恥感，也稱為病恥感，是一種負面的內(nèi)在感受，給患者自身、家庭甚至社會帶來不良影響遠遠超出疾病本身[9]。因此，尋找乳腺癌高靈敏度、高特異性的生物學分子標志物和有效的分子治療靶點迫在眉睫。

研究結(jié)果表明lncRNA雖不編碼或極少編碼蛋白，但在人類基因的表達調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[10]，它在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的機制眾多，其中一種機制是lncRNA作為分子海綿，競爭性結(jié)合miRNA，從而影響miRNA對靶基因的調(diào)控[11]。作為lncRNA家族的成員，XIST在許多腫瘤中表達異常，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。近年的研究結(jié)果表明XIST可作為多種miRNA的分子海綿在特定的腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用，也可作為一種miRNA的分子海綿在多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用。如XIST在結(jié)直腸癌中高表達，其可通過miR-200b-3p調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的進展和轉(zhuǎn)移，也可通過miR-486-5p/神經(jīng)黏蛋白-2（NRP-2）促進結(jié)直腸癌細胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，還可通過miR-132-3p在結(jié)直腸癌中發(fā)揮致癌作用[5,12-13]；XIST在胃癌中高表達，可通過miR-497/MACC1促進胃癌細胞生長和侵襲，也可通過miR-185/TGF-β1促進胃癌的發(fā)展，還可通過miR-101/EZH2調(diào)控胃癌發(fā)展的進程[6,14-15]。而XIST在乳腺癌方面的研究較少，所涉及的miRNA目前只有三種，即miR-155[16]、miR-503[17]和miR-20a[18]，且只有miR-155和miR-20a被證實能與XIST通過結(jié)合位點直接結(jié)合。因此，XIST在乳腺癌細胞中的作用及其對乳腺癌的調(diào)控機制具有深入的研究價值。

MTT檢測結(jié)果表明XIST過表達可抑制MCF-7細胞的增殖，與Zheng[16]和Zhao等[18]的研究結(jié)果一致，進一步證實了XIST過表達對乳腺癌細胞增殖的影響，但Transwell小室遷移和侵襲實驗結(jié)果表明XIST過表達可促進MCF-7細胞的遷移和侵襲，與Zheng[16]和Zhao等[18]的研究結(jié)果相反，進一步分析發(fā)現(xiàn)，Zheng等[16]主要研究的是chrX:73069396-73069414所轉(zhuǎn)錄的XIST片段，Zhao等[18]主要研究的是chrX:73042794-73042817所轉(zhuǎn)錄的XIST片段，而本文研究的主要是chrX:73062562-73062583所轉(zhuǎn)錄的XIST片段。于是我們推測：這幾項研究中XIST過表達對MCF-7細胞遷移和侵襲的影響不同可能是因為XIST序列的不同片段可競爭結(jié)合的miRNA不同。我們利用starBase V2.0軟件預測與XIST有結(jié)合位點的miRNA，并結(jié)合qRT-PCR檢測結(jié)果以及已有的文獻資料，發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p與本研究所構(gòu)建的XIST過表達序列有結(jié)合位點，且miR-130b-3p在乳腺癌細胞MCF-7中的表達水平明顯高于人正常乳腺上皮細胞MCF-10A中的表達水平；此外Miao等[19]的研究結(jié)果表明miR-130b過表達可促進MCF-7細胞的增殖，Shui等[20]的研究結(jié)果表明miR-130b-3p過表達可抑制MCF-7細胞的遷移和侵襲，與本文研究結(jié)果一致。本研究中XIST對乳腺癌細胞功能的影響可能是通過XIST作為分子海綿競爭性結(jié)合miR-130b-3p，然后抑制miR-130b-3p的表達來實現(xiàn)的。為證實這一推測，本研究利用lncRNA XIST過表達質(zhì)粒及其陰性對照質(zhì)?；騧iR-130b-3p Inhibitor及Inhibitor N.C瞬時轉(zhuǎn)染MCF-7細胞并用qRT-PCR進行檢測，結(jié)果表明XIST過表達后MCF-7細胞中miR-130b-3p的表達水平降低，而miR-130b-3p低表達后MCF-7細胞中XIST的表達水平增加。

綜上所述，在乳腺癌MCF-7細胞中XIST低表達、miR-130b-3p高表達，二者呈負相關(guān)，而XIST過表達可抑制MCF-7細胞增殖、促進細胞遷移和侵襲，這可能是通過抑制miR-130b-3p表達來調(diào)控的，但其具體機制需要進一步證實。