侯霞 ,周永安,田樹雄,李超,李敏,任蕊蕊,韓雅馨,程建萍,李星星,李哲,白園
乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅著全球女性的健康[1]。2019年的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,乳腺癌占女性新發(fā)腫瘤的30%,病死率為15%,與2018年的癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)相比,乳腺癌仍位居女性新發(fā)腫瘤的第一位、腫瘤相關(guān)死亡原因第二位,且病死率呈上升趨勢(shì)[2-3]。因此,闡明乳腺癌發(fā)生發(fā)展的病理生理學(xué)過程,不僅有利于篩選新的高靈敏度和高特異性生物學(xué)分子標(biāo)志物,也有助于找尋新的分子治療靶點(diǎn),從而達(dá)到控制乳腺癌發(fā)病率、降低乳腺癌死亡率的目的。
lncRNA XIST(X inactive specific transcript)即X染色體失活特異性轉(zhuǎn)錄本,是長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)家族成員之一,位于X染色體失活中心[4],是哺乳動(dòng)物中X染色體失活的主要調(diào)節(jié)因子。最近的研究表明XIST在結(jié)直腸癌[5]、胃癌[6]、骨肉瘤[7]等許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,而且在不同腫瘤中其作用的分子機(jī)制有所不同,但是在乳腺癌中的作用尚未完全闡明。在前期研究中,我們通過文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)XIST在乳腺癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)降低[8],并利用qRT-PCR檢測(cè)了乳腺癌組織及癌旁正常組織中XIST的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)XIST在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯低于在癌旁正常組織中的表達(dá)水平,因此在本研究中我們首先通過qRTPCR檢測(cè)人乳腺正常上皮細(xì)胞以及乳腺癌細(xì)胞系中XIST的表達(dá)水平,并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步檢測(cè)XIST對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響,盡可能揭示其中潛在的分子機(jī)制。
人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。lncRNA XIST過表達(dá)質(zhì)粒及其陰性對(duì)照質(zhì)粒為本課題組構(gòu)建,miR-130b-3p Inhibitor和miRNA陰性對(duì)照購自上海吉瑪制藥有限公司。
RPMI 1640培養(yǎng)基和DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基購自以色列BI公司,胎牛血清購自四季青公司,胰島素(INS)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)購自加拿大Abm公司,Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司,TRIzol購自日本TaKaRa公司,InRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)、lnRcute lncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)、miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒和miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)購自天根生化科技有限公司,qRT-PCR所用特異性引物(表1)由上海生工生物工程股份有限公司合成,噻唑藍(lán)(MTT)和結(jié)晶紫購自索萊寶科技有限公司,Transwell小室購自美國Corning公司。
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MCF-7細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),MCF-10A細(xì)胞用含5%胎牛血清、10 μg/ml INS、20 ng/ml EGF和500 ng/ml氫化可的松的DMEM/F12(1:1)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)基中均添加適量青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液,使其終濃度為100 U/ml的青霉素、100 μg/ml的鏈霉素和0.05 mg/ml的慶大霉素。MCF-7和MCF-10A細(xì)胞均置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Sequence of qRT-PCR primers
1.2.2 RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測(cè) 按照TRIzol說明書提取細(xì)胞總RNA;以2 μg總RNA為模板,按照InRcute lncRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)和miRcute增強(qiáng)型miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,所得cDNA產(chǎn)物保存在-20℃冰箱中;以相應(yīng)cDNA為模板,按照lnRcute lncRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)和miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(SYBR Green)說明書進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增檢測(cè),其中l(wèi)ncRNA XIST檢測(cè)以GAPDH為內(nèi)參,miRNA檢測(cè)以U6為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前一天取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞接種于6孔板中,細(xì)胞密度達(dá)60%~80%時(shí)按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行操作,將XIST過表達(dá)質(zhì)粒(XIST overexpression)及其陰性對(duì)照質(zhì)粒(Blank)或miR-130b-3p Inhibitor及miRNA陰性對(duì)照(Inhibitor N.C)分別轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染過程中使用無血清、無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染6 h后更換為含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞,qRTPCR檢測(cè)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST和miRNA的表達(dá)水平,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 將轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞消化、重懸,制備單細(xì)胞懸液,按每孔2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別在第1、2、3、4和5天檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的增殖能力,具體操作如下:吸去舊培養(yǎng)基,每孔加入200 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)和20 μl MTT溶液,培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h;吸去上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,振蕩10 min,用酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔的吸光度值(OD)。
1.2.5 Transwell小室遷移實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞消化、重懸,用無血清的培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液,細(xì)胞濃度為3×104個(gè)每毫升,Transwell小室的上室中加入200 μl細(xì)胞懸液,下室中加入500 μl含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后,用棉簽小心擦去上室中的細(xì)胞,將小室用PBS洗3次,然后用4%多聚甲醛固定液室溫固定20 min,用棉簽吸去上室中液體,0.1%結(jié)晶紫室溫避光染色10 min,流水沖洗小室,晾干水分后拍照并計(jì)數(shù)。
1.2.6 Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn) 將預(yù)冷的Matrigel膠與無血清的RPMI 1640培養(yǎng)基按1:9比例混勻,按每孔80 μl將膠均勻包被于Transwell小室底部膜內(nèi),置于培養(yǎng)箱中使之成膠。其余步驟與細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)相同。
1.2.7 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)XIST靶向的miRNA利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(starBase V2.0)在線查找與XIST序列有潛在結(jié)合位點(diǎn)的miRNA。
qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,XIST在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)水平遠(yuǎn)低于在乳腺正常上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)水平,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖1。
qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與Blank組相比,轉(zhuǎn)染XIST過表達(dá)質(zhì)粒后MCF-7細(xì)胞中XIST表達(dá)水平明顯提高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001),見圖2。MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組相比,XIST過表達(dá)后MCF-7細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),見圖3。
圖1 XIST在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中低表達(dá)Figure 1 XIST expression in MCF-7 breast cancer cells was lower than that in MCF-10A normal breast epithelial cells
圖2 XIST轉(zhuǎn)染后XIST表達(dá)水平增加Figure 2 XIST transfection increased XIST expression in MCF-7 breast cancer cells
圖3 XIST過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖能力Figure 3 XIST overexpression inhibited proliferation of MCF-7 cells
Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與Blank組相比,XIST overexpression組細(xì)胞數(shù)量明顯增加,表明XIST過表達(dá)后MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)(P=0.0024),見圖4。
圖4 XIST過表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力 (×100)Figure 4 XIST overexpression promoted migration and invasion of MCF-7 cells (×100)
starBase V2.0預(yù)測(cè)結(jié)果表明與XIST有潛在結(jié)合的miRNA共有8個(gè),分別為miR-130b-3p、miR-10b-5p、miR-92b-3p、miR-454-3p、miR-106a-5p、miR-20a-5p、miR-301a-3p和miR-106b-5p;根據(jù)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果篩選出2-ΔΔCt≥2或2-ΔΔCt≤0.5的miRNA作為本實(shí)驗(yàn)確定差異表達(dá)的miRNA,同時(shí)查閱文獻(xiàn)尋找與XIST過表達(dá)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程影響一致的miRNA,發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p是唯一符合條件的miRNA,見表2。
表2 starBase V2.0預(yù)測(cè)與XIST有潛在結(jié)合的miRNATable 2 Binding sites of microRNA to XIST predicted by StarBase V2.0 software
miR-130b-3p序列以及與所研究的XIST序列按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則的結(jié)合位點(diǎn)見圖5A。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,miR-130b-3p在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于在乳腺正常上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0001);與Blank組相比,XIST過表達(dá)后MCF-7細(xì)胞中miR-130b-3p表達(dá)水平顯著降低(P=0.0068),見圖5B、5C。
圖5 XIST過表達(dá)可降低MCF-7細(xì)胞中miR-130b-3p的表達(dá)水平Figure 5 Overexpression of XIST reduced expression of microRNA-130b-3p in MCF-7 cells
qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明,miR-130b-3p Inhibitor及Inhibitor N.C瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞后,與Inhibitor N.C組相比,miR-130b-3p Inhibitor組miR-130b-3p的表達(dá)水平明顯降低且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與Inhibitor N.C組相比,miR-130b-3p Inhibitor組細(xì)胞中XIST表達(dá)水平顯著增加(P<0.001),見圖6。
圖6 miR-130b-3p低表達(dá)可增加MCF-7細(xì)胞中XIST的表達(dá)水平Figure 6 Low-expression of miR-130b-3p increased expression of XIST in MCF-7 cells
隨著社會(huì)的發(fā)展,人們的生活方式、飲食習(xí)慣以及自然環(huán)境都發(fā)生著巨大的變化,乳腺癌發(fā)病人數(shù)逐年增加。乳腺癌不僅嚴(yán)重威脅患者的健康,還給患者家庭帶來沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),而且乳腺癌治療帶來的乳房缺陷、脫發(fā)、皮膚顏色改變等各種身體改變會(huì)使患者產(chǎn)生明顯的羞恥感,也稱為病恥感,是一種負(fù)面的內(nèi)在感受,給患者自身、家庭甚至社會(huì)帶來不良影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出疾病本身[9]。因此,尋找乳腺癌高靈敏度、高特異性的生物學(xué)分子標(biāo)志物和有效的分子治療靶點(diǎn)迫在眉睫。
研究結(jié)果表明lncRNA雖不編碼或極少編碼蛋白,但在人類基因的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用[10],它在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制眾多,其中一種機(jī)制是lncRNA作為分子海綿,競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA,從而影響miRNA對(duì)靶基因的調(diào)控[11]。作為lncRNA家族的成員,XIST在許多腫瘤中表達(dá)異常,與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5-7]。近年的研究結(jié)果表明XIST可作為多種miRNA的分子海綿在特定的腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用,也可作為一種miRNA的分子海綿在多種腫瘤中發(fā)揮調(diào)控作用。如XIST在結(jié)直腸癌中高表達(dá),其可通過miR-200b-3p調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移,也可通過miR-486-5p/神經(jīng)黏蛋白-2(NRP-2)促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,還可通過miR-132-3p在結(jié)直腸癌中發(fā)揮致癌作用[5,12-13];XIST在胃癌中高表達(dá),可通過miR-497/MACC1促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲,也可通過miR-185/TGF-β1促進(jìn)胃癌的發(fā)展,還可通過miR-101/EZH2調(diào)控胃癌發(fā)展的進(jìn)程[6,14-15]。而XIST在乳腺癌方面的研究較少,所涉及的miRNA目前只有三種,即miR-155[16]、miR-503[17]和miR-20a[18],且只有miR-155和miR-20a被證實(shí)能與XIST通過結(jié)合位點(diǎn)直接結(jié)合。因此,XIST在乳腺癌細(xì)胞中的作用及其對(duì)乳腺癌的調(diào)控機(jī)制具有深入的研究?jī)r(jià)值。
MTT檢測(cè)結(jié)果表明XIST過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞的增殖,與Zheng[16]和Zhao等[18]的研究結(jié)果一致,進(jìn)一步證實(shí)了XIST過表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響,但Transwell小室遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明XIST過表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲,與Zheng[16]和Zhao等[18]的研究結(jié)果相反,進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Zheng等[16]主要研究的是chrX:73069396-73069414所轉(zhuǎn)錄的XIST片段,Zhao等[18]主要研究的是chrX:73042794-73042817所轉(zhuǎn)錄的XIST片段,而本文研究的主要是chrX:73062562-73062583所轉(zhuǎn)錄的XIST片段。于是我們推測(cè):這幾項(xiàng)研究中XIST過表達(dá)對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲的影響不同可能是因?yàn)閄IST序列的不同片段可競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的miRNA不同。我們利用starBase V2.0軟件預(yù)測(cè)與XIST有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA,并結(jié)合qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果以及已有的文獻(xiàn)資料,發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p與本研究所構(gòu)建的XIST過表達(dá)序列有結(jié)合位點(diǎn),且miR-130b-3p在乳腺癌細(xì)胞MCF-7中的表達(dá)水平明顯高于人正常乳腺上皮細(xì)胞MCF-10A中的表達(dá)水平;此外Miao等[19]的研究結(jié)果表明miR-130b過表達(dá)可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的增殖,Shui等[20]的研究結(jié)果表明miR-130b-3p過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲,與本文研究結(jié)果一致。本研究中XIST對(duì)乳腺癌細(xì)胞功能的影響可能是通過XIST作為分子海綿競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-130b-3p,然后抑制miR-130b-3p的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。為證實(shí)這一推測(cè),本研究利用lncRNA XIST過表達(dá)質(zhì)粒及其陰性對(duì)照質(zhì)粒或miR-130b-3p Inhibitor及Inhibitor N.C瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞并用qRT-PCR進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明XIST過表達(dá)后MCF-7細(xì)胞中miR-130b-3p的表達(dá)水平降低,而miR-130b-3p低表達(dá)后MCF-7細(xì)胞中XIST的表達(dá)水平增加。
綜上所述,在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中XIST低表達(dá)、miR-130b-3p高表達(dá),二者呈負(fù)相關(guān),而XIST過表達(dá)可抑制MCF-7細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲,這可能是通過抑制miR-130b-3p表達(dá)來調(diào)控的,但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步證實(shí)。