劉全亮，徐江廣，陳長(zhǎng)金，劉佛林，曾慶明，黃若輝

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科 贛南醫(yī)學(xué)院泌尿外科研究所，江西 贛州 341000)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，大約90%為尿路上皮癌。膀胱癌的復(fù)發(fā)率很高，60%～70%的患者可能復(fù)發(fā)，11%復(fù)發(fā)的患者可進(jìn)展為浸潤(rùn)性腫瘤[1-2]。膀胱腫瘤可以直接侵犯周圍器官，還可以通過(guò)血運(yùn)途徑的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致其他重要生命器官功能障礙，加上腫瘤細(xì)胞本身高代謝導(dǎo)致的過(guò)度消耗，以及其引起的出血、感染、免疫損傷最終導(dǎo)致病人的死亡[3-5]。然而，目前膀胱腫瘤的總體治療效果并不令人滿意。

現(xiàn)有研究證實(shí)感受器電位離子通道蛋白V亞族2(Transient receptor potential vanilloid 2，TRPV2)和膀胱腫瘤存在著密切的關(guān)系[6-7]，Sara Caprodossi[7]研究發(fā)現(xiàn)隨著臨床分級(jí)的增高，TRPV2在腫瘤組織中的表達(dá)量也隨著增高，而通過(guò)經(jīng)陰道無(wú)張力吊帶手術(shù)獲得的正常的膀胱組織的標(biāo)本中的TRPV2的表達(dá)量較低。為了探討TRPV2對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的增殖和遷移的影響，我們采用小干擾RNA技術(shù)(sh-RNA)抑制TRPV2基因在人膀胱癌EJ細(xì)胞的表達(dá)，觀察其對(duì)EJ細(xì)胞增殖及遷移侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料人膀胱癌細(xì)胞株EJ購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)于美國(guó)Gibco公司。脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)于Invitrogen公司。兔抗人TRPV2單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)SantaCruze公司。噻唑藍(lán)(MTT)、二甲亞砜(DMSO)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司。Transwell小室購(gòu)于美國(guó)Corning公司。Matrigel膠購(gòu)于美國(guó)Millipore公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及含sh-RNA-TRPV2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EJ細(xì)胞用含8%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EJ細(xì)胞以1×105個(gè)/孔密度接種于6孔板中，次日當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)到75%～85%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。根據(jù)Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑手冊(cè)進(jìn)行操作，每孔加入用無(wú)雙抗及血清的培養(yǎng)基稀釋的4 μg質(zhì)粒和10 μL的Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑。細(xì)胞轉(zhuǎn)染分組如下：(1)干擾組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1+EGFP-ShRNA-TRPV2；(2)陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1+EGFP；(3)空白對(duì)照組：用PBS代替質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后24 h，更換新鮮完全培養(yǎng)基(含8%血清和雙抗)。48 h后倒置熒光顯微鏡下觀測(cè)轉(zhuǎn)染效率。當(dāng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率達(dá)到75%以上可繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。sh-RNA-TRPV2序列 (正義鏈序列：5'-GGTAAGACGTGCCTGATGA-3')。

1.3 Western blot檢測(cè)TRPV2蛋白的表達(dá)6孔板每孔種入4×105個(gè)細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h，用預(yù)冷PBS洗滌2次，每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液，收集到EP管中，冰上裂解20 min，無(wú)明顯的沉淀物后4 ℃離心12 000 rpm離心5 min。分別取3組總蛋白各50 μL總樣品經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h后，羊抗人TRPV2單克隆抗體(1∶500)4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鼠抗羊抗體(1∶5 000)室溫孵育60 min，TBST洗膜3次后，ECL增強(qiáng)發(fā)光，X線膠片曝光。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔500個(gè)/100 μL的密度接種于96孔板中，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。分別于在第1、2、3、4、5和6天，每孔加入MTT工作液50 μL，37 ℃、5%CO2后細(xì)胞培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL的DMSO溶液，室溫振蕩15 min，使結(jié)晶充分溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度(A)值。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力孔板內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞至完全融合，在高倍鏡下看到無(wú)明顯的細(xì)胞間隙，同時(shí)也無(wú)細(xì)胞重疊擠壓。用標(biāo)準(zhǔn)200 μL槍頭做平行劃痕，每孔2條。用PBS 輕柔清洗3遍，洗脫脫壁的細(xì)胞，其后加入含1%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。并且于劃痕后0 h、12 h和24 h倒置顯微鏡下監(jiān)測(cè)劃痕寬度，每孔隨機(jī)選擇4個(gè)不同視野觀測(cè)。

1.6 Transwell檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力將上述轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞分別接種于8 μm的事先鋪好(用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基以1∶4稀釋Matrigel膠)transwell小室，接種密度為1×105/孔，上室為含0.2% BSA無(wú)血清培養(yǎng)基，下室為含10%FBS的全血清培養(yǎng)基。于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，棄去小室內(nèi)培養(yǎng)基，小心擦干室內(nèi)的Matrigel膠，輕柔漂洗后甲醇固定，后采用0.1%結(jié)晶紫染色液進(jìn)行染色15 min。在高倍鏡下分別取正中、正上、正下、正左、正右這五個(gè)隨機(jī)視野行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1小干擾RNA技術(shù)(sh-RNA) 對(duì)TRPV2基因的抑制作用Western blot結(jié)果顯示干擾組的TRPV2蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組，而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組間無(wú)明顯區(qū)別。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明小干擾sh-RNA-TRPV2轉(zhuǎn)染成功并能有效下調(diào)目的蛋白TRPV2的表達(dá)，而空載體對(duì)于TRPV2基因的蛋白水平表達(dá)無(wú)影響(圖1)。

圖1 蛋白定量檢測(cè)干擾效果Western blot結(jié)果顯示在干擾組的TRPV2的蛋白表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組的表達(dá)，表明干擾有效。

2.2小干擾RNA技術(shù)(sh-RNA)TRPV2對(duì)于細(xì)胞增殖的影響細(xì)胞生長(zhǎng)曲線提示干擾組較空白對(duì)照組與陰性對(duì)照組的細(xì)胞增殖速度在第3天以后出現(xiàn)明顯的減慢，第3、4、5、6、7天的細(xì)胞抑制率分別為7.8%、16.4%、33.2%和34.2%(P<0.05)。而空白組和陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

2.3小干擾RNA技術(shù)(sh-RNA)TRPV2對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響劃痕實(shí)驗(yàn)在劃痕6 h 3組差異不明顯，在12 h干擾組的劃痕距離與空白對(duì)照組，陰性對(duì)照組相比明顯較寬(圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sh-RNA-TRPV2轉(zhuǎn)染后下調(diào)TRPV2能抑制EJ細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè)

2.4小干擾RNA技術(shù)(sh-RNA)TRPV2對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響sh-RNA干擾組穿膜細(xì)胞數(shù)為(34.2±2.4)個(gè)，而空白對(duì)照組為(84.4±5.3)個(gè)、陰性對(duì)照組為(81.6±2.6)個(gè)，干擾組與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與陰性對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖4)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明sh-RNA-TRPV2轉(zhuǎn)染后能有效降低膀胱腫瘤EJ細(xì)胞株的侵襲能力。

圖4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè)

3 討 論

膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率近年來(lái)呈上升趨勢(shì)[2]。目前我國(guó)對(duì)于膀胱腫瘤的治療主要有膀胱內(nèi)藥物化療，以及手術(shù)治療、放射治療以及化學(xué)治療。但是，目前膀胱腫瘤的總體治療效果不能令人滿意，人們正在積極尋求新的治療手段。隨著較多的癌基因的發(fā)現(xiàn)，通過(guò)針對(duì)腫瘤相關(guān)的癌基因的人工調(diào)節(jié)來(lái)治愈腫瘤成為可能，這導(dǎo)致靶向基因水平治療腫瘤成為目前的研究熱點(diǎn)[6]。膀胱腫瘤多見(jiàn)為尿路上皮癌，位置表淺，可以借助腔道鏡等設(shè)備達(dá)到直視的效果，定位清楚，是非常理想的靶向基因治療對(duì)象。而目前膀胱腫瘤的治療難點(diǎn)就是腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部侵襲。

瞬時(shí)受體電位(Transient receptor potential，TRP)離子通道是一類分布廣泛的陽(yáng)離子通道蛋白，參與機(jī)體內(nèi)多種感覺(jué)傳導(dǎo)和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理功能。TRPV(Transient receptor potential vanilloid)通道作為TRP離子通道中的V型亞家族，是一類與哺乳動(dòng)物溫度感受及機(jī)械感受密切相關(guān)的離子通道[3-5]。目前有許多研究認(rèn)為這一類陽(yáng)離子通道和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。作為這個(gè)亞家族的重要的成員之一，感受器電位離子通道蛋白V亞族2(TRPV2)最初被稱為香草酸樣受體蛋白l(Vanilloid receptor-like protein 1，VR-L1)，它主要分布在感受傷害性熱和機(jī)械刺激的有髓神經(jīng)和一部分C神經(jīng)纖維中[3-5]。TRPV2作為TRP離子通道中的V型亞家族的第二個(gè)成員，是一個(gè)非選擇性的鈣離子通道，而眾所周知鈣離子作為常見(jiàn)的第二信使，能傳遞細(xì)胞外刺激和信號(hào)，調(diào)控基因的表達(dá)，在許多的細(xì)胞功能發(fā)揮極其重要的作用[4-7]。而在腫瘤細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)改變可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞分化以及細(xì)胞凋亡的重要作用。前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)TRPV2基因在膀胱腫瘤高表達(dá)，并且蛋白的表達(dá)量與臨床病理分級(jí)呈正相關(guān)，而在正常的膀胱上皮細(xì)胞表達(dá)量卻很低[7]。但是，TRPV2對(duì)于腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特性，及有關(guān)增殖和遷移的影響尚未明確。sh-RNA技術(shù)具有高效性和高度特異性[8]等優(yōu)點(diǎn)，目前已成為基因功能研究中的一種快速、簡(jiǎn)便的新方法。我們采用了sh-RNA這一技術(shù)特異性的干擾膀胱腫瘤細(xì)胞株EJ的TRPV2的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)干擾后的EJ腫瘤細(xì)胞較對(duì)照的EJ腫瘤在體外的細(xì)胞增殖能力與遷移侵襲能力有了明顯的下降。我們采用的特異性的短發(fā)卡序列sh-RNA-TRPV2能夠成功轉(zhuǎn)染至膀胱腫瘤細(xì)胞EJ細(xì)胞株，并且能夠得到穩(wěn)定的表達(dá)下調(diào)TRPV2基因在膀胱腫瘤中的表達(dá)，大大降低了腫瘤在體外的增殖和遷移侵襲能力。

綜上所述，利用sh-RNA干擾技術(shù)抑制TRPV2基因表達(dá)可有效抑制膀胱癌EJ細(xì)胞的體外增殖、侵襲和遷移。TRPV2基因可能作為一個(gè)新的臨床治療膀胱腫瘤的靶點(diǎn)，為臨床上治療膀胱腫瘤提供新思路。但sh-RNA抑制TRPV2基因表達(dá)影響膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移及侵襲的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。