祝小薦，萬紹貴

(贛南醫(yī)學(xué)院分子病理中心，江西 贛州 341000)

癌癥是威脅人類生命健康的主要疾病，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)2018年估計(jì)，僅2018年一年高達(dá)960萬人死于癌癥，且全世界罹患癌癥的人數(shù)還在迅速增長。最主要的原因之一是無法獲得精準(zhǔn)的檢測和治療。準(zhǔn)確評估腫瘤的內(nèi)在分子特點(diǎn)對于采取臨床有效的治療方法至關(guān)重要，分子診斷技術(shù)的進(jìn)步有助于揭示腫瘤的內(nèi)在特性。

臨床上，組織活檢仍是評估大部分腫瘤特異性改變的主要手段[1]。組織活檢通常取自原發(fā)性腫瘤組織，取樣方法往往具有侵襲性，且由于腫瘤自身的異質(zhì)性，使其不能準(zhǔn)確追蹤腫瘤的動(dòng)態(tài)變化?；诮M織活檢的腫瘤評估具有很大的局限性，開發(fā)新的檢測方法是解決腫瘤危害的關(guān)鍵。臨床上，迫切需要使用非侵入性或微創(chuàng)方法，對腫瘤患者的基因組變化進(jìn)行系統(tǒng)和實(shí)時(shí)監(jiān)測。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，液體活檢技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，提供了一種非侵入性的、可重復(fù)取樣的便捷手段，應(yīng)用于腫瘤患者的輔助診斷、個(gè)體化治療、療效監(jiān)測以及跟蹤預(yù)測耐藥性突變和預(yù)后的評估等領(lǐng)域。

液體活檢，是基于血液或其他體液樣本的非侵入性技術(shù)。來自癌癥患者的體液樣本的液體活檢包含完整的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell,CTCs)、細(xì)胞來源的囊泡 (如外泌體)以及來自腫瘤細(xì)胞的游離RNA和DNA等。這些都是評估腫瘤特異性可靠的樣本來源，且由于液體活檢的無創(chuàng)性，只要有必要，就可重復(fù)取樣，以便于實(shí)時(shí)觀察腫瘤內(nèi)部的動(dòng)態(tài)變化。cfDNA起初在健康人的血液中被發(fā)現(xiàn)[2]，然而未被重視。直至1977年， Leon等[3]研究者發(fā)現(xiàn)循環(huán)血液中游離DNA (circulating cell-free DNA cfDNA)濃度在淋巴瘤和肺、卵巢、子宮、子宮頸等腫瘤患者中升高。10年后，Stroun等[4]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤患者較健康人血液中存在更為豐富的cfDNA。 1989年，研究者報(bào)道了在癌癥患者的cfDNA中檢測到與腫瘤基因組變化一致的片段[4],ctDNA首次進(jìn)入人們的視野。ctDNA是一種存在于血液中的cfDNA,它是起始于腫瘤細(xì)胞。通常，在體內(nèi)大多數(shù)腫瘤細(xì)胞都會(huì)釋放出一些自身攜帶的DNA。普遍的說法是認(rèn)為ctDNA擁有多個(gè)起源，最常見的是：(1)凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞，(2)活的腫瘤細(xì)胞，(3)循環(huán)的腫瘤細(xì)胞[5-7]。CTCs是從原發(fā)腫瘤或轉(zhuǎn)移部位釋放進(jìn)入血液的腫瘤細(xì)胞。相對于基于ctDNA的分析，CTCs捕獲的復(fù)雜性和高成本可能會(huì)限制其應(yīng)用[8-9]。同時(shí)，作為生物標(biāo)記物的ctDNA檢測比CTCs檢測具有更高的敏感性[10]。而且，ctDNA的半衰期短，15分鐘到幾小時(shí)不等，在血漿中呈動(dòng)態(tài)性的變化。且由于ctDNA的改變與腫瘤基因組一致，ctDNA可能是腫瘤基因組的潛在替代物，可以利用ctDNA實(shí)時(shí)監(jiān)測腫瘤基因組的變化，在腫瘤學(xué)的研究中極具潛力。

1 ctDNA檢測方法

血液作為液體活檢最主要的樣本來源。在血清中，cfDNA的含量可能是血漿中cfDNA含量的2～24倍[11-12]。但血漿的應(yīng)用性依然優(yōu)于血清，主要是血清制備過程中可能會(huì)增加野生型DNA水平，且血漿中cfDNA突變量高[13]，對腫瘤的突變分析更占優(yōu)勢。盡管cfDNA含量在癌癥患者體內(nèi)高于健康人，但是，由于肝脾腎的清除作用，cfDNA釋放到循環(huán)的含量依然很低，來源于腫瘤細(xì)胞的ctDNA比例更可能低至0.01%[14]。因此，ctDNA的標(biāo)準(zhǔn)化分析檢測對液體活檢的臨床應(yīng)用至關(guān)重要。隨著分子技術(shù)的發(fā)展，很多方法可以用于ctDNA的分析檢測。結(jié)合快速微流控分析的數(shù)字PCR顯著提高ctDNA檢測的敏感性，可以對核酸進(jìn)行絕對定量[15]。在Bettegowda[10]的一項(xiàng)大型研究中，采用數(shù)字PCR評估ctDNA檢測腫瘤的能力，75%晚期卵巢癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等以及50%原發(fā)性腦癌、前列腺癌、腎癌可被檢出。cheng[16]也采用液滴數(shù)字PCR (ddPCR)技術(shù)檢測188例轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的基因突變。此外，結(jié)合了數(shù)字PCR以及流式技術(shù)的BEAMing分析對ctDNA突變檢測也有較高的敏感性。Li等[17]曾利用甲基化-BEAMing準(zhǔn)確測定樣品DNA中甲基化分子的數(shù)量。Krug等[18]研究也發(fā)現(xiàn)經(jīng)BEAMing分析檢測ctDNA EGFR激活的敏感性為82%，對EGFR T790M突變的敏感性為84%。此外，高通量測序(NGS)、全基因組測序(WGS) 、全外顯子組測序(WES)及ARMS等均是檢測ctDNA的可行方法。

2 ctDNA在腫瘤個(gè)性化治療上的臨床應(yīng)用

液體活檢在臨床上的應(yīng)用是多方面的，ctDNA作為一種可以提供腫瘤關(guān)鍵信息，廣泛適用于癌癥的潛在生物標(biāo)志物也備受期待(圖1)。

圖1 ctDNA的潛在應(yīng)用

2.1評估腫瘤疾病負(fù)擔(dān)Bettegowda評估了大量的癌癥類型發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)腦外實(shí)體瘤中均可檢測到ctDNA(82%)。同時(shí)，患者體內(nèi)ctDNA濃度與腫瘤的類型、分期及進(jìn)展有關(guān)。他們的研究發(fā)現(xiàn)局限性癌癥患者血漿ctDNA濃度低于轉(zhuǎn)移性癌癥患者，晚期癌癥患者或轉(zhuǎn)移患者血液循環(huán)中，突變DNA片段濃度相對較高[10]。此外，早有研究者發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)移性癌癥患者中ctDNA濃度高于大多數(shù)常用生物標(biāo)志物[19]，而晚期乳腺癌患者與ctDNA濃度也存在類似的聯(lián)系[20]。腦脊液中ctDNA深度測序也被證明是可以檢測腦干腫瘤特異性改變的可靠技術(shù)[21]。Spina等[22]回顧分析了349例CHL癌癥患者血液和組織樣本，表示ctDNA確實(shí)可以提供腫瘤組織內(nèi)包括cHL分期及預(yù)后在內(nèi)的關(guān)鍵信息。在結(jié)腸癌或胰腺癌中無法治愈的階段， ctDNA也被發(fā)現(xiàn)可能反映晚期癌癥的疾病負(fù)擔(dān)。腫瘤的疾病負(fù)擔(dān)是指腫瘤帶來的人類各方面的損失，這不止是身體上的，還包括精神以及經(jīng)濟(jì)方面的損失等。通常早期患者的ctDNA水平較低，ctDNA大多數(shù)在患者疾病中晚期階段被發(fā)現(xiàn), ctDNA在早期腫瘤患者的豐度是大約10倍低于進(jìn)展期的患者，還需要進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)，以達(dá)到可接受的早期癌癥檢測靈敏度。ctDNA的豐度確實(shí)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系，這種聯(lián)系很可能是正相關(guān)的，提示其可作為腫瘤疾病負(fù)擔(dān)的替代標(biāo)志物。

在不同癌癥類型和分期中，ctDNA檢測出的片段大小也不同。早在20多年前，人們就發(fā)現(xiàn)健康人平均血漿DNA長度超過癌癥患者[23]。不久前，Mouliere等[24]對來自18種不同癌癥類型的患者的344份血漿樣本和來自健康對照組的65份血漿樣本中生成的cfDNA片段特征分析發(fā)現(xiàn)，健康個(gè)體血漿和晚期膠質(zhì)瘤、腎癌、胰腺癌、膀胱癌患者血漿cfDNA片段長度明顯長于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、黑色素瘤、結(jié)腸直腸癌、膽管癌等晚期癌癥。他們發(fā)現(xiàn)對cfDNA片段大小分析和特定片段大小的選擇性測序可促進(jìn)ctDNA檢測。Florent等[25]也發(fā)現(xiàn)腫瘤來源的ctDNA根據(jù)ctDNA片段的大小呈現(xiàn)出特定的量譜。不難發(fā)現(xiàn)， ctDNA的總長度始終小于正常無細(xì)胞DNA的片段長度。Underhill等[26]的研究也為這結(jié)果提供了令人信服的證據(jù)。因此，來自各種實(shí)體腫瘤的cfDNA和ctDNA在片段長度上的這種細(xì)微但明顯的差異為ctDNA在實(shí)體腫瘤檢測和診斷中的臨床應(yīng)用提供了潛在的標(biāo)志物，且在監(jiān)測腫瘤復(fù)發(fā)，評估腫瘤對治療的反應(yīng)上也有一定的價(jià)值。

2.2監(jiān)測治療反應(yīng)診斷出癌癥后，制定合適的治療管理方案是最重要的一環(huán)。腫瘤個(gè)性化治療的一個(gè)重點(diǎn)，在于干預(yù)特定突變驅(qū)動(dòng)信號。由ctDNA定義的大多數(shù)常見突變已經(jīng)被用于監(jiān)測癌癥患者的治療，包括肺癌EGFR基因突變、結(jié)直腸癌KRAS基因突變、乳腺癌TP53、PIK3CA基因突變、前列腺癌AR基因突變等。例如，Murtaza[27]和他的同伴為探索治療后轉(zhuǎn)移性癌癥的基因組進(jìn)化，對大量來自血漿樣本中的癌癥外顯子組測序，包括紫杉醇治療后PIK3CA的激活突變;順鉑治療后RB1的截?cái)嗤蛔?用他莫昔芬和曲妥珠單抗治療后MED1發(fā)生截?cái)嗤蛔?，吉非替尼治療后表皮生長因子受體EGFR T790M突變，這些突變表達(dá)增加可以解釋治療后出現(xiàn)的耐藥性。ctDNA KRAS分析也被證明可以用于監(jiān)測胰腺導(dǎo)管腺癌(PDAC)患者的治療反應(yīng)，且發(fā)現(xiàn)其至少與常用的生物標(biāo)志物CA199作用相當(dāng)，甚至隨著時(shí)間推移，比CA199的動(dòng)態(tài)變化更能預(yù)測患者生存和預(yù)后[28]。研究員們還試圖通過ctDNA尋找可靶向治療的突變，在Spina等[22]的研究中，通過收集了經(jīng)典霍奇金淋巴瘤(CHL)患者化療或免疫治療后以及治療后復(fù)發(fā)的縱向標(biāo)本，來評估治療帶來的腫瘤基因上的改變。另一項(xiàng)研究里，Taus等[29]對33例肺腺癌患者的221份血漿標(biāo)本進(jìn)行了分析，在83%的患者和100%的胸外轉(zhuǎn)移患者血漿中檢測到EGFR突變。他們分析發(fā)現(xiàn)EGFR突變負(fù)荷的動(dòng)態(tài)變化可以預(yù)測患者治療反應(yīng)和疾病進(jìn)展，而且這種預(yù)測發(fā)生在放射學(xué)評估之前。一些ctDNA標(biāo)記甚至可以指導(dǎo)腫瘤的治療，血漿中發(fā)現(xiàn)EGFR致敏突變的非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腺癌患者可以用厄洛替尼治療[30]，血漿T790M陽性的患者可使用奧西莫替尼治療[31]，野生型KRAS原發(fā)性結(jié)直腸腫瘤患者可接受EGFR治療[32]， ctDNA中BRCA2突變的轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者被證實(shí)對順鉑化療更為敏感[16]。Wolff等[33]證明以血液為基礎(chǔ)的RAS突變試驗(yàn)，可以替代組織RAS檢測，確定轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌(mCRC)患者是否適合抗EGFR治療。一項(xiàng)Ⅲ期臨床試驗(yàn)也證實(shí)，口服表皮生長因子受體(EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(TKI)藥物厄洛替尼聯(lián)合吉西他濱可延長晚期胰腺癌患者無進(jìn)展生存期[34]。Zou[35]也強(qiáng)調(diào)了連續(xù)ctDNA監(jiān)測在接受靶向治療和免疫治療的NSCLC患者中的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。綜上可見，ctDNA檢測可提醒耐藥性突變的出現(xiàn)，并提示治療中腫瘤狀態(tài)的改變，有利于監(jiān)測腫瘤演變以及預(yù)測耐藥性，為腫瘤患者的精準(zhǔn)治療提供依據(jù)。

2.3預(yù)后的評估近年來，由于很難獲得足夠數(shù)量和質(zhì)量的腫瘤組織，且重復(fù)活檢受到各種條件的限制，給腫瘤治療的預(yù)后研究帶來了困難?；赾tDNA的液體活檢有助于克服這個(gè)困難。在一項(xiàng)前瞻性研究中[36]，ctDNA的存在與晚期胰腺癌較差的總生存率以及手術(shù)后較短的無病生存期相關(guān)，ctDNA被證明是晚期胰腺腺癌的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物。同樣，Spina和他的同伴們[22]也發(fā)現(xiàn)在ABVD方案(阿霉素、博萊霉素、長春花堿和達(dá)卡巴嗪)治療2個(gè)療程后，完全緩解或治愈的CHL患者比復(fù)發(fā)患者ctDNA濃度下降更大。不久前， Turner等[37]觀察到早期乳腺癌治療后檢測到ctDNA與其復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，且其對所有腫瘤亞型均有預(yù)測作用。Coombes等[38]也得到了相似的結(jié)果。相關(guān)的研究也展示了ctDNA在結(jié)直腸癌[39]及黑色素瘤[40]等治療后復(fù)發(fā)的預(yù)測作用。當(dāng)然，由于研究樣本量小，ctDNA的檢測是否對全部癌癥都有預(yù)后價(jià)值還需進(jìn)一步研究。由于ctDNA的半衰期短，可以動(dòng)態(tài)的監(jiān)測腫瘤基因組的變化，實(shí)時(shí)提供分子異常信息?；赾tDNA可發(fā)現(xiàn)影響預(yù)后的突變，這在很多研究中有所體現(xiàn)。例如Provencio等[41]研究表明EGFR T790M突變等位基因頻率與NSCLC患者死亡和疾病進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)顯著正相關(guān)。Zhang等[42]也認(rèn)為，在隨訪過程中密切監(jiān)測EGFR突變，可以預(yù)測接受酪氨酸激酶抑制劑(TKI)靶向治療的NSCLC患者的預(yù)后。Yam等[43]研究也得到相似的結(jié)果。ctDNA中的BRCA逆轉(zhuǎn)突變更是能預(yù)測高級別卵巢癌對PARP抑制劑的原發(fā)性和獲得性耐藥[44]。此外，胰腺癌的KRAS突變[16]，非小細(xì)胞肺癌的EGFR突變[45]，乳腺癌的HER2[46]等都與不良預(yù)后有關(guān)。研究證明，ctDNA的功用不止如此，其在預(yù)測腫瘤手術(shù)后復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移上也有足夠的潛力，Sausen[47]也通過ctDNA分析比放射成像早6個(gè)月發(fā)現(xiàn)9例手術(shù)后胰腺癌患者的復(fù)發(fā)。甚至，在1例同時(shí)患乳癌與直腸癌的中年女性在接受手術(shù)治療2年后，ctDNA圖譜提示與直腸癌樣本相同的多種體細(xì)胞突變，由此證實(shí)了直腸癌復(fù)發(fā)[48]。Maron等[49]還探索ctDNA基因組改變的分布在進(jìn)展期胃食管腺癌的預(yù)后影響。ctDNA分析可用于評估特定基因、ctDNA負(fù)擔(dān)以及腫瘤內(nèi)分子異質(zhì)性，有望成為預(yù)后和預(yù)測的生物標(biāo)志物，值得進(jìn)一步研究。

2.4其他某些特定性突變可提示腫瘤的特殊類型，例如，BRAF癌基因的點(diǎn)突變主要見于甲狀腺乳頭狀癌[50]。p53突變也發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、肺癌、食道癌、乳腺癌、肝癌、腦癌、內(nèi)皮網(wǎng)癌和造血癌等不同類型的癌癥中常見，且p53的突變譜各不相同[51]。對ctDNA中這些突變的分析可以為這些不同腫瘤的病因和個(gè)性化治療靶點(diǎn)提供線索。也有研究探索ctDNA在癌癥患者的早期檢測上的意義，確實(shí)，ctDNA檢測有助于對胰腺癌[52]、乳腺癌[37]及非小細(xì)胞肺癌[53]等腫瘤的早期診斷，且有可能實(shí)現(xiàn)早期預(yù)測腫瘤的進(jìn)化和轉(zhuǎn)移[54-56]?？上У氖窃缙诩膊≈衏tDNA濃度極低，且循環(huán)突變片段起源組織的這種不確定性也為基于ctDNA進(jìn)行的腫瘤早期檢測增加了困難和挑戰(zhàn)[57]。

3 困難與挑戰(zhàn)

ctDNA作為有意義的生物學(xué)標(biāo)志物，在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)和個(gè)性化治療上展示了巨大的潛力。ctDNA檢測為癌癥診斷、監(jiān)測、預(yù)后判斷和治療提供了一種無侵入性、簡便易行的方法。更甚之，與傳統(tǒng)的檢測方法相比，ctDNA檢測可以提供更為完整的生物學(xué)信息[58]。然而，ctDNA的臨床使用上仍然存在困難。如ctDNA的高碎片化和循環(huán)中的低濃度，對其定量及檢測是一種挑戰(zhàn)。其次，方法的標(biāo)準(zhǔn)化、敏感性、與腫瘤組織的一致性、調(diào)控問題等需要考慮。同時(shí)，不同人的 ctDNA 水平有所差異。對此，需要對可靠的、標(biāo)準(zhǔn)化的ctDNA檢測方法達(dá)成一致。 第三，cfDNA也被發(fā)現(xiàn)在生理和非癌變病理?xiàng)l件下濃度增加，而且，有研究表明，即使是那些從未患過癌癥的人，癌癥相關(guān)的突變也會(huì)隨著年齡的增長而發(fā)生[59]。這對通過ctDNA圖譜檢測突變和疾病的預(yù)判增加了難度。最后，ctDNA檢測的成本效益也值得重視，盡管不少公司和實(shí)驗(yàn)室在開發(fā)這類測試方面非常積極，但其高成本還是限制其臨床應(yīng)用?？傊?，盡管ctDNA液體活檢具有高靈敏和微/無創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)，這一領(lǐng)域的發(fā)展在癌癥的精準(zhǔn)治療中具有廣闊的前景，但其完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測方法還有很長的一段路要走，其廣泛應(yīng)用在臨床前還需進(jìn)一步探索。