★ 陳宇悍 閆鵬舉 張菁楠 于蓮 蘇瑾 *

(佳木斯大學(xué)藥學(xué)院黑龍江省生物藥制劑重點實驗室 黑龍江 佳木斯154007)

滿山紅油是杜鵑花科植物興安杜鵑(RhododendrondauricumL.)的葉經(jīng)水蒸氣蒸餾提取的揮發(fā)油，其味辛、苦，性寒，有文獻報道，滿山紅油具有止咳、祛痰的功效，用于急、慢性支氣管炎，療效高、副作用小，其主要成分有杜鵑酮、葎草烯、石竹烯等[1]。已報道的滿山紅油制劑有片劑(如消咳喘片)、膠囊劑(復(fù)方滿山紅膠囊)、滴丸劑等，常規(guī)的制劑方法容易造成揮發(fā)油成分的散失，且因其氣味，服用后容易引起胃腸道不適。

自乳化釋藥系統(tǒng)(self-emulisifying drug delivery systems, SEDDS)由藥物、油相、表面活性劑和輔助表面活性劑形成的口服固體或液體給藥系統(tǒng)，乳化所需要的自由能低，體系在體外37 ℃水浴、溫和攪拌下或在胃腸道蠕動下，能自發(fā)形成粒徑小于500 nm的水包油型乳劑[2]。采用自乳化釋藥技術(shù)對滿山紅油進行制劑設(shè)計，利用有效成分存在于細小的油滴中，可從胃中迅速排空的特點，使藥物在整個胃腸道中廣泛分布，顯著提高藥物的生物利用度，還可克服普通乳劑服用體積大、穩(wěn)定性不易控制等缺點，為提高滿山紅治療慢性支氣管炎的臨床效果提供一個更有效的途徑。

本實驗通過溶解度實驗、正交試驗和偽三元相圖的繪制，采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化滿山紅油自乳化系統(tǒng)處方，以乳化時間和乳滴的有效粒徑為指標，對處方中的油相、乳化劑的用量配比進行篩選，選出最優(yōu)處方及質(zhì)量比，為制備滿山紅油臨床應(yīng)用新劑型提供參考。

1 材料

1.1 試藥 滿山紅油(江西恒誠天然香料油有限公司，批號20180101)；聚氧乙烯蓖麻油(EL-40，德國BASF公司)聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH-40，德國BASF公司)；吐溫-80(Tween 80，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；肉豆蔻酸異丙酯(IPM)，辛酸/癸酸甘油三酯(GTCC)(臨沂市蘭山區(qū)綠森化工有限公司)；大豆油(中糧集團有限公司)。

1.2 儀器 Malvern Zetasizer Nano ZSE 納米粒度電位儀(英國馬爾文公司)；XW-80A渦旋儀(上海精科實業(yè)有限公司)；80-2離心機(上海浦東物理化學(xué)儀器廠)；98-1-B型電子恒溫加熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)

2 方法與結(jié)果

2.1 溶解度實驗 取1 mL滿山紅油，置于具塞離心管中，分別與1 mL大豆油、辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸異丙酯、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氫化蓖麻油、吐溫-80混合，渦旋混勻3 min后，于4000 r·min-1離心3 min，觀察滿山紅油在其中的溶解情況[3]。由實驗觀察到，辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸異丙酯和大豆油均可與滿山紅油相混溶，可作為油相。滿山紅油在吐溫-80、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氫化蓖麻油中皆能均勻溶解分散，呈黃色澄明液，高速離心無分層，也無析出物，所以吐溫-80、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氫化蓖麻油可用作滿山紅油處方表面活性劑。

2.2 處方中輔料的篩選 通過正交試驗篩選處方，根據(jù)體外乳化試驗結(jié)果，確定油相及表面活性劑。如表1所示，以油相(A)和表面活性劑(B)作為考察的2個因素，選用辛酸/癸酸甘油三酯、肉豆蔻酸異丙酯和大豆油，以及吐溫80、聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氫化蓖麻油分別作為2個因素的3個水平。自乳化制劑處方中油相比例一般為35%～70%(質(zhì)量分數(shù))，表面活性劑比例為30%～60%(質(zhì)量分數(shù))，口服SEDDS處方油相和表面活性劑的經(jīng)典配比為質(zhì)量比7∶3[4]，按照m(揮發(fā)油)∶m(油相)∶m(表面活性劑)為200 mg∶350 mg∶150 mg設(shè)計正交實驗，通過觀察乳液的外觀、析油量、是否乳化以及乳化時間進行評價，利用正交設(shè)計表對處方進行篩選。

根據(jù)正交表分別配制出9組溶液，依次取樣于離心管中，渦旋混勻后，觀察溶液是否分層，然后轉(zhuǎn)移至盛有37 ℃、50 mL蒸餾水燒杯中，用玻璃棒緩慢攪拌，觀察乳化效果。其未乳化的油量以水層上飄浮的油的面積來確定。

表1 正交水平設(shè)計表

表2 正交試驗篩選結(jié)果

注：乳液析油量：-未析出，+<25%，++<50%，+++<75%，++++<100%。

結(jié)果顯示，油相為肉豆蔻酸異丙酯時較容易被乳化，得到的乳化效果最好，且與其他表面活性劑混合時穩(wěn)定、不分層，大豆油很難被乳化，乳液析油量大且有明顯的分層現(xiàn)象。表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油時乳化能力最強，吐溫-80次之，聚氧乙烯氫化蓖麻油最弱。第8組處方形成的乳劑澄清透明，有乳光，乳化效果較其他組理想。因此最優(yōu)的處方中油相為肉豆蔻酸異丙酯，表面活性劑為聚氧乙烯蓖麻油。以偽三元相圖進一步確定自乳化配比。

2.3 偽三元相圖的繪制和最佳處方比例篩選 確定滿山紅油SEDDS處方的輔料后，將油相與乳化劑按照9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9的質(zhì)量比分別混合均勻[5]，將滿山紅油加入，使每一份混合體系中滿山紅油的質(zhì)量分數(shù)分別為45%、30%、15% 和0% 制備多個自乳化樣品。對上述自乳化樣品的乳化效果、乳液的穩(wěn)定性進行體外評價，并通過納米粒度儀測定乳滴的粒徑大小。符合要求的自乳化樣品有如下特征：樣品很快溶解于水，形成的乳液呈白色或澄明，不析油、不分層，粒徑≤ 0.5μm、且分布均勻[6]。用origin 8.0繪制滿山紅油SEDDS的偽三元相圖[7]，結(jié)果見圖1。

圖1 滿山紅揮發(fā)油、聚氧乙烯蓖麻油、肉豆蔻酸異丙酯的偽三元相圖

陰影部分為自乳化區(qū)，可以看出，滿山紅揮發(fā)油、肉豆蔻酸異丙酯和聚氧乙烯蓖麻油的質(zhì)量分數(shù)范圍分別為0%～45%，7%～60%，25.5%～63%，當(dāng)處方三相的質(zhì)量分數(shù)位于偽三元相圖的成乳區(qū)域之內(nèi)時，都可以形成乳化效果較好的自乳化劑。

2.4 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化處方 選取滿山紅油(X1)、油相(X2)與乳化劑(X3)作為考察因素，以中位粒徑大小(Y1)、自乳化時間(Y2)作為響應(yīng)值，采用Box-Behnken法優(yōu)化工藝，優(yōu)化滿山紅油自乳化系統(tǒng)處方。試驗中每個因素的3個水平分別記為-1、0、+1(表3)。

2.4.1 考察因素對粒徑的影響

應(yīng)用Design-Expert trial version 8.0.6對表5中的數(shù)據(jù)進行分析?？疾煲蛩貙π?yīng)值1(中位粒徑)的影響結(jié)果見表5。由表5可知，預(yù)測模型的P<0.0001，模型顯著。失擬項P=0.2502，大于0.05說明模型對真實情況的模擬是準確的，綜合來看該預(yù)測模型可以用于滿山紅油自乳化處方的優(yōu)化。因素A的P=0.0002，因素B、C的P值 <0.0001，說明滿山紅油，IPM，EL-40對粒徑有很顯著的影響[8]。

表3 Box-Behnken 響應(yīng)面法優(yōu)化處方

表4 BBD設(shè)計與結(jié)果

表5 自乳化粒徑回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果

注:*P<0.05，**P<0.01。

擬合得到二次回歸方程為：Y1=100.66+21.18 A+44.70 B-39.81 C+8.23 AB-10.92 AC-21.37 BC-1.59 A2-8.85 B2+0.76 C2。方程擬合后的結(jié)果顯示，其相關(guān)系數(shù) r2=0.9849，預(yù)測模型可靠，可以很好地描述出實驗的真實情況，采用該方程代替真實的實驗點進行分析，能真實反映實驗結(jié)果[9]。

圖2表示的響應(yīng)面圖顯示不同的獨立變量對滿山紅油自乳化處方粒徑的影響，結(jié)果表明，隨著EL-40用量的升高，粒徑逐漸減??；隨著滿山紅油和IPM用量的升高，粒徑逐漸增大。

圖2 粒徑的響應(yīng)面三維圖

2.4.2 考察因素對乳化時間的影響

表6 自乳化乳化時間回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果

注:*P<0.05，**P<0.01。

應(yīng)用Design-Expert trial version 8.0.6對表6中的數(shù)據(jù)進行分析。考察因素對效應(yīng)值2(乳化時間)的影響結(jié)果見表6。由表6可知，預(yù)測模型的P<0.0001，模型顯著。失擬項的P=0.4181，大于0.05，能準確地模擬出實驗的真實情況，綜合來看該預(yù)測模型可以用于滿山紅油自乳化處方的優(yōu)化。因素A的P=0.0001，因素B、C的P值均小于0.0001，說明滿山紅油，IPM，EL-40對乳化時間的影響都很顯著。

擬合得到二次回歸方程為：Y2=21.17+2.66 A+6.37 B-5.46 C+2.66 AB-5.18 AC-5.42 BC+0.25 A2-1.09 B2+2.85 C2。方程擬合后的結(jié)果顯示，其相關(guān)系數(shù) r2=0.9923，預(yù)測模型可靠，能很好地描述真實情況，使用該方程代替真實的實驗點進行分析是可行的，能真實反映實驗結(jié)果。

圖 3 表示的響應(yīng)面圖顯示不同的獨立變量對滿山紅油自乳化處方對乳化時間的影響，結(jié)果表明，隨著滿山紅油和IPM用量的增加，乳化時間逐漸增大；隨著EL-40用量的增加，乳化時間逐漸減小。

圖3 乳化時間的響應(yīng)面三維圖

2.5 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化與分析 根據(jù)多項式方程，分別繪制各指標與響應(yīng)值交互項的響應(yīng)面曲面圖，確定各因素對滿山紅油自乳化處方的影響。通過 Design Expert 8.0.6 軟件進行擬合作圖，所得響應(yīng)面圖和等高線圖，可直觀地反映各個因素和響應(yīng)值及各因素間的交互作用[10]。最后通過軟件計算，分析得到各因素的最優(yōu)處方中滿山紅油，IPM，EL-40的質(zhì)量分別為0.45g，0.07g，0.63g。

2.6 驗證試驗 根據(jù)優(yōu)化的最佳處方，分別精密稱取滿山紅油、IPM、EL-40各0.45g，0.07g，0.63g，制備 3 批滿山紅油自乳化樣品，預(yù)測粒徑為29.89nm，自乳化時間11.59s。以最佳預(yù)測的處方比例進行驗證試驗，結(jié)果各指標的偏差絕對值均較小，證實所建模型預(yù)測性良好，方法可行，結(jié)果見表7。

表7 Box-Behnken 響應(yīng)面優(yōu)化法的驗證

注：偏差%=(預(yù)測值-實測值)/預(yù)測值×100%。

3 討論

滿山紅油作為止咳祛痰，治療急、慢性支氣管炎的臨床用藥，資源豐富、療效確切，具有很高的開發(fā)價值和應(yīng)用前景，但其有較強的疏水性，導(dǎo)致不能發(fā)揮出全部的藥效，生物利用度較低。自乳化釋藥系統(tǒng)可提高藥物的溶解度，促進藥物的吸收速度和程度，提高生物利用度，降低毒副作用，且多數(shù)情況下其吸收比單純制備普通片劑或膠囊劑更迅速、更有效，因此，采用自乳化釋藥技術(shù)處理滿山紅油后再進行制劑開發(fā)，可以更好的發(fā)揮臨床治療效果。

自乳化乳液的粒徑是評價自乳化效果的一個至關(guān)重要的指標，粒徑越小，乳液越穩(wěn)定，越容易被機體吸收，生物利用度越高[11]。乳化時間能夠直觀的反應(yīng)出自乳化制劑的乳化效率，乳化時間越短，效率越高。本實驗采用 Box-Behnken 響應(yīng)面法篩選的滿山紅揮發(fā)油SEDDS處方，制得自乳化系統(tǒng)乳液的粒徑布均勻，性質(zhì)穩(wěn)定，且處方中原料藥為揮發(fā)油，具有充當(dāng)油相的效果，提高有效成分含量。

自乳化系統(tǒng)通常由三種或三種以上的物質(zhì)組成，處方中各組分存在交互作用且彼此間不同的配比會影響自乳化液的粒徑及乳化時間。本實驗在偽三元相圖的基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken 響應(yīng)面法對處方進行細化，可以直觀、準確地篩選出最優(yōu)處方，使其更具有科學(xué)性。最優(yōu)處方的響應(yīng)值與預(yù)測值相吻合，為該自乳化釋藥體系制備滿山紅油口服納米乳或軟膠囊等劑型方面提供有益參考。