楊彬，王志耕

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

依諾肝素鈉是堿解聚伊諾肝素芐基酯制備而成的低分子肝素[1]，是目前抗凝、抗栓治療的主要藥物[2-3]。制備肝素芐基酯的酯化率與反應(yīng)物濃度、溫度及時(shí)間等因素相關(guān)[4]。傳統(tǒng)工藝耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，需要20～35 h以上[5-8]。超聲波反應(yīng)溫和，在傳質(zhì)、傳熱和化學(xué)反應(yīng)等方面具有獨(dú)特作用，已廣泛應(yīng)用于生物、化工、制造等領(lǐng)域[9]。本實(shí)驗(yàn)引入超聲波制備肝素芐基酯，期望縮短反應(yīng)時(shí)間、提高產(chǎn)率和酯化率，減少有機(jī)物的使用和殘留，獲得最優(yōu)制備工藝。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

肝素鈉，工業(yè)品；肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品、多硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所；苯甲醇、高氯酸鋰、芐索氯銨(97%)、磷酸、磷酸二氫鈉、甲醇、氫氧化鈉、醋酸鈉、冰乙酸、二氯甲烷等均為分析純；氯化芐、甲醇、乙腈均為優(yōu)級(jí)純。

ACQUITY UPLC H-CLASS 超高效液相色譜儀；Breeze 2 高壓液相色譜儀；Specord S600紫外可見記錄分光光度儀；MS205DU和 AL104型電子分析天平；3670離心機(jī)；KQ500DE型超聲波清洗器；DZF-6090型真空干燥箱。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗品肝素鈉的純化 稱取粗品肝素鈉40 g，溶于含12 g氯化鈉的400 mL去離子水溶液中。加入320 mL甲醇，攪拌、沉淀1 d。過(guò)濾。濾餅40 ℃真空干燥。測(cè)定蛋白核酸的紫外吸收值和多硫酸軟骨素含量。

1.2.2 肝素季銨鹽的制備 將純化的19.4 g肝素鈉溶于200 mL純水中，注入含50 g芐索氯銨的250 mL水溶液中，攪拌并離心，用水不斷沖洗，直到?jīng)_洗液變透明，獲得肝素季銨鹽，45 ℃真空干燥。

1.2.3 肝素芐基酯的制備 將1 g肝素季銨鹽加入到5 mL二氯甲烷中，攪拌溶解。加入氯化芐1 mL，放入超聲功率為400 W的超聲波清洗器中，溫度為35～40 ℃，超聲反應(yīng)5.5 h，做3個(gè)平行樣。反應(yīng)結(jié)束后，加入6 mL的10%醋酸鈉甲醇溶液[4]，得肝素芐基酯沉淀，離心，用甲醇反復(fù)洗滌，直到無(wú)刺激性氣味，于45 ℃真空干燥24 h。

1.3 多硫酸軟骨素的檢測(cè)

1.3.1 色譜條件[10]Waters Breeze 2高效液相色譜儀，Waters 2489紫外檢測(cè)器，色譜柱TSK-GEL EDAE-5pw(75 mm ×2 mm，10 μm)，流動(dòng)相A為2.5 mmol/L 磷酸二氫鈉(用磷酸調(diào)節(jié)至pH 3.0，0.22 μL 濾膜)，流動(dòng)相B為2.5 mmol/L磷酸二氫鈉、1 mol/L高氯酸鋰(用磷酸調(diào)節(jié)至pH 3.0，0.22 μL濾膜)，梯度洗脫方法：0～2 min，10%B-10%B；3～7 min，20%B-20%B；7～15 min：20%B-100%B；5～25 min：100%B-100%B；檢測(cè)波長(zhǎng)202 nm，柱溫箱35 ℃，進(jìn)樣量10 μL，流速0.2 mL/min。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制0.40，1，1.7 mg/mL的多硫酸軟骨素標(biāo)液，經(jīng)HPLC檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以濃度(mg/mL)為縱坐標(biāo)(y)，以面積為橫坐標(biāo)(x)，回歸方程為y=8×10-8x+0.258(R2=0.961)，結(jié)果表明硫酸軟骨素溶液在0.4～1.7 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.3 樣品分析 用超純水配制成含20.0 mg/mL的原料肝素鈉和純化后的肝素鈉溶液。以超純水為溶劑，配制含1 mg/mL肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用HPLC測(cè)定多硫酸軟骨素含量，與對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)品比較。純化后的肝素鈉中多硫酸軟骨素含量必須小于總含量的2%。

1.4 肝素芐基酯含量分析

本研究將酯化率定義為肝素芐基酯水解后的苯甲醇質(zhì)量與肝素芐基酯質(zhì)量的百分比。

1.4.1 色譜條件 超高效液相色譜儀Waters Uplc Class超高效液相色譜儀，TUC detector檢測(cè)器，色譜柱ACQUITY UPLC?BEH C18(1.7 μm 2.1 mm×50 mm)，流動(dòng)相[11]為水∶乙腈∶甲醇=80∶15∶5，檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣體積1 μL，流速0.5 mL/min，運(yùn)行時(shí)間2 min。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 配制濃度0.5 mg/mL的苯甲醇標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，稀釋至0.05，0.07，0.1，0.15，0.175 mg/mL的工作液，過(guò)0.22 μL濾膜后進(jìn)HPLC分析，苯甲醇濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)(x)，以測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程y=182 307x-227.79，R2=0.999 9，表明甲醇溶液在0.05～0.175 mg/mL線性相關(guān)性好，根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對(duì)水解液中的苯甲醇進(jìn)行定量分析。

1.4.3 樣品分析 取0.125 g肝素芐基酯于25 mL容量瓶中，加入1 mol/L NaOH溶液5 mL，室溫反應(yīng)1 h。加1 mL冰醋酸，終止反應(yīng)。加水定容至25 mL，使得肝素芐基酯的終濃度為5 mg/mL[12-13]。取1 μL按照上述HPLC條件測(cè)定樣品中苯甲醇的峰面積，經(jīng)回歸方程測(cè)得其濃度，計(jì)算酯化率。

酯化率=(C2/C1)×100%

“我很高興自己能駕駛這輛沃爾沃P1800通勤這么多年，它也從未因故障把我落在路邊。我希望能一直就這么開著它，直到有一天我離開人世。其實(shí)，它的狀態(tài)遠(yuǎn)比我的身體狀態(tài)要好很多?！?/p>

式中，C1為待測(cè)樣品肝素芐基酯的質(zhì)量濃度，C2為待測(cè)液中苯甲醇的質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與討論

2.1 肝素鈉粗品純化后的雜質(zhì)分析

肝素主要分布在動(dòng)物細(xì)胞的肥大組織中，與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，而這種復(fù)合物無(wú)抗凝血活性，蛋白質(zhì)去除后肝素的抗凝活性才得以體現(xiàn)[14]。目前主要通過(guò)酶水解、鹽析等方法去除原料肝素鈉中的蛋白質(zhì)，得到肝素鈉粗品。因經(jīng)酶水解后的肝素鈉原料中蛋白質(zhì)被分解為多肽，且含有如硫酸軟骨素類的雜質(zhì)，又不易在高溫，強(qiáng)酸強(qiáng)堿等情況下去除蛋白質(zhì)，易使肝素鈉失去活性。肝素的純化一般為氧化法，加雙氧水、高錳酸鉀等，得率低，且影響活性。粗品肝素鈉40 g經(jīng)純化后得到為19.7 g肝素鈉，測(cè)定結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 0.4 mg/mL 原料液波段掃描圖Fig.1 Band scan figure of crude heparin solution at 0.4 mg/mL

圖2 純化后0.4 mg/mL肝素鈉溶液波段掃描圖Fig.2 Band scan figure of purified heparin solution at 0.4 mg/mL

由圖1、圖2可知，粗品肝素鈉在A260、A280的吸收值為2.937 1和1.650 9，純化后為0.374 6和0.218 4。用甲醇純化石，蛋白質(zhì)和核酸含量明顯降低，粗品肝素鈉在180～200 nm處有很多的雜峰，經(jīng)純化后，峰型單一，在A190處有肝素鈉的特征性吸收峰。整個(gè)純化過(guò)程溫和且沒(méi)有引入新雜質(zhì)，起到了很好的除雜效果。

2.2 多硫酸軟骨素的檢測(cè)

多硫酸軟骨素的結(jié)構(gòu)、電荷密度、分子量、抗凝活性均與肝素相似，因此在肝素鈉中發(fā)現(xiàn)OSCS較為不易。肝素鈉中有關(guān)物質(zhì)尤其是多硫酸軟骨素的分析成了肝素類藥物研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)[15]，快速檢出摻雜了OSCS的肝素鈉是提高肝素鈉相關(guān)產(chǎn)品安全性和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵。各溶液測(cè)定結(jié)果見圖3。

圖3 各物質(zhì)的液相色譜圖Fig.3 Liquid chromatogram of solutions of standard sample， crude heparin and its purified product

由圖3可知，多硫酸軟骨素和肝素鈉出峰時(shí)間分別為13.878 min和17.235 min，分離度較好。本實(shí)驗(yàn)用的粗品肝素鈉采用酶法生產(chǎn)，原料液和純化液中均未發(fā)現(xiàn)有OSCS。純化液峰面積與肝素鈉標(biāo)樣峰面積的比值為15.69，而原料液與肝素鈉標(biāo)樣峰面積的比值為9.98，20 mg/mL純化液中肝素鈉含量為20 mg/mL，為原料肝素鈉含量的1.57倍，純度提高了57.21%，雜質(zhì)被分離。

2.3 超聲波輔助酯化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 超聲功率對(duì)肝素芐基酯的影響 將反應(yīng)液放入超聲波清洗器中，溫度為35～40 ℃，超聲酯化反應(yīng)3 h。超聲波功率對(duì)肝素芐基酯酯化率的影響見圖4。

圖4 超聲功率對(duì)酯化率的影響Fig.4 The effect of ultrasonic power on esterification level

由圖4可知，隨超聲功率增大，酯化率增大，超聲功率在400 W時(shí)，酯化率較高，以后增加趨于平緩。超聲波在通過(guò)液體時(shí)產(chǎn)生空化氣泡，氣泡在超聲波傳播時(shí)，振蕩破裂，造成熱力效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)和化學(xué)效應(yīng)[16]，加速了物質(zhì)分子間的碰撞，從而加快反應(yīng)，縮短反應(yīng)時(shí)間，提高酯化率[17]。當(dāng)超聲波功率由低到高時(shí)，產(chǎn)生的空化作用由弱變強(qiáng)，引起酯化率顯著增加。當(dāng)超聲功率達(dá)到500 W的時(shí)候，酯化率的增加速度有所降低，以防功率過(guò)高，引起肝素芐基酯長(zhǎng)鏈分子的降解，所以選擇最佳超聲功率為400 W。

由圖5可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，酯化率逐漸提高，5 h以后其提高速率有所減緩。在超聲過(guò)程中，超聲波振蕩產(chǎn)生的強(qiáng)烈空穴效應(yīng)、自由基效應(yīng)[18]、熱力學(xué)和非熱力學(xué)等多重效應(yīng)的作用，增強(qiáng)了分子間的作用力，同時(shí)其自由基效應(yīng)在空穴氣泡崩饋時(shí)，其氣泡內(nèi)部氣相在高溫高壓條件下裂解成 —H和 —OH，以及在空穴氣泡與周邊液體界面上由于極端的溫差導(dǎo)致能量集中，使溶液熱解產(chǎn)生自由基的現(xiàn)象，加速了酯化作用。酯化作用不可能無(wú)限的進(jìn)行，當(dāng)溶液達(dá)到飽和時(shí)，酯化反應(yīng)達(dá)到平衡，酯化率將不再升高。在超聲4 h時(shí)，其酯化率已達(dá)到4.72%，相當(dāng)于在水浴中反應(yīng)25 h的酯化率4.65%。超聲5～6 h，酯化率增加趨于減緩，所以確定最佳超聲時(shí)間為5.5 h。

圖5 時(shí)間對(duì)酯化率的影響Fig.5 The effect of time on esterification rate

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在肝素芐基酯的反應(yīng)中，金飛等人已研究證明當(dāng)溫度為35～40 ℃時(shí)，酯化率較好。同時(shí)二氯甲烷的沸點(diǎn)為40 ℃，如果溫度過(guò)高，也會(huì)影響肝素季銨鹽的活性，影響低分子肝素鈉的效價(jià)，所以選擇時(shí)間和功率，作為主要因素，采用Design-Expert8.0.06響應(yīng)面設(shè)計(jì)中的Miscellaneous模型優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，以肝素芐基酯酯化率為響應(yīng)值，因素與水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 酯化率優(yōu)化設(shè)計(jì)及編碼水平Table 1 Optimum design factor and level of heparin benzyl esterfication

表2 Miscellaneous實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The Miscellaneous design and its results

2.4.1 模型的建立及其顯著性分析 利用Design-Expert8.0.0.6軟件對(duì)上表數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到響應(yīng)值(Y)對(duì)編碼自變量的二次多項(xiàng)回歸方程是：Y=5.55+0.17A+0.50B+0.10AB-0.33A2-0.36B2。對(duì)該模型進(jìn)行回歸方差分析和顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 The response surface analysis of variance

由表3可知，模型F值為 12.105 3，概率P=0.002 5<0.05，模型顯著；模型的失擬項(xiàng)p=0.636 5>0.05，表明模型能夠解釋99.80%的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，模型的變異系數(shù)CV%=1.59，說(shuō)明模型的精密度好。同時(shí)，方程的失擬項(xiàng)F值為0.623 2，概率P>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說(shuō)明回歸方程在整個(gè)回歸區(qū)域的擬合情況良好，可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

由表3可知，對(duì)響應(yīng)值作用極顯著的是B，作用顯著的是A2、B2，說(shuō)明響應(yīng)值與因素之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系；時(shí)間對(duì)酯化率的影響非常明顯。

2.4.2 響應(yīng)面曲線圖 采用Design-Expert8.0.0.6軟件繪制響應(yīng)面曲線圖，結(jié)果見圖6。

圖6 超聲功率和時(shí)間對(duì)酯化率的響應(yīng)面圖Fig.6 A response surface plot of ultrasonic power and reaction time on esterification rate

由圖6可知，隨著時(shí)間和功率的增加，酯化率逐漸增加，功率400～500 W時(shí)，酯化率隨著時(shí)間的增加，達(dá)到了最佳值；當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到一定程度后，會(huì)逐漸降低。

2.4.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化及模型驗(yàn)證 模型給出的最優(yōu)預(yù)測(cè)值為超聲功率400 W，反應(yīng)5.5 h，溫度35～40 ℃時(shí)，理論酯化率為5.55%。在上面的條件下做3個(gè)平行樣，實(shí)際測(cè)得值為5.35%，與預(yù)測(cè)值相對(duì)偏差為3.60%，與理論值基本吻合。說(shuō)明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的酯化條件準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

(1)利用甲醇純化肝素鈉原料，純化后肝素鈉含量為純化前的1.57倍；利用弱陰離子高效液相法檢測(cè)，測(cè)得樣品中不含多硫酸軟骨素。

(2)超聲制備肝素芐基酯的優(yōu)化條件為：溫度35～40 ℃，超聲功率400 W，反應(yīng)時(shí)間5.5 h，酯化率為5.35%。比常規(guī)工藝節(jié)省了20 h左右，且酯化率提高15.05%。