劉效波，荊麗杰，劉寶堂，侯文明，李磊，趙進，李子軍

濰坊醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心血管外科，山東濰坊 261031

缺血性心肌?。╥schemic cardiomyopathy，ICM）屬于特殊或晚期階段的冠心病的一種，心肌慢性缺血主要由冠狀動脈粥樣硬化導(dǎo)致，心肌細(xì)胞彌漫性纖維化或壞死而形成的疾病[1]。 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bonemar rowstem cells，BMSCs）是一類存在于骨髓中的具有分

化成多種體內(nèi)細(xì)胞潛能的細(xì)胞群， 目前是研究的熱點，可通過對特定條件的控制誘導(dǎo)其分化成特定細(xì)胞或組織[2]。 正是因BMSCs 的可分化形成骨、軟骨、脂肪、神經(jīng)及成肌細(xì)胞的多種分化潛能，在體外增殖迅速、易獲取等特點，將其作為修復(fù)機體損傷治療用干細(xì)胞已逐漸成為研究熱點，但研究將其作為基因治療的靶細(xì)胞的卻較少[3]。該實驗擬將病毒介導(dǎo)的bFGF基因轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs，觀察bFGF 在BMSCs內(nèi)表達與否及其表達率，并觀測轉(zhuǎn)染bFGF 后其細(xì)胞增殖及分化等生物學(xué)功能的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 健康清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠10 只，體重在(180±20)g 左右，由中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗室提供。 在恒溫（24±2）℃、12 h 循環(huán)光照的實驗環(huán)境中，在造模前喂養(yǎng)7 d 以適應(yīng)新環(huán)境。

1.1.2 藥品和試劑 胎牛血清（Clark 公司），DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone 公司），胰蛋白酶（碧云天公司），bFGF的ELISA 試劑盒（R&D 公司），bFGF 抗體（Sigma 公司）。 bFGF 片段(武漢博士德生物)，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒(美國R&D 公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠ICM 模型的制備 根據(jù)文獻[4]大鼠ICM 模型的制備采用冠狀動脈左前降支結(jié)扎法。首先用水合氯醛注射液麻醉大鼠，然后通過呼吸機連接氣管對其進行插管以保持呼吸順暢。從大鼠左側(cè)的胸骨第4 根肋骨間打開胸腔以暴露心臟，冠脈左前降支走行于左心耳與動脈圓錐之間深處，利用無創(chuàng)小圓針7-0 絲線將心臟結(jié)扎，可見左室前壁因缺血出現(xiàn)紫紺，心電圖顯示ST 段弓背向上抬高。 從造模開始到造模后喂養(yǎng)期間，大鼠死亡數(shù)別是3 只。

1.2.2 BMSCs 的提取與培養(yǎng) 大鼠造模成功后斷頸處死，75%乙醇中浸泡滅菌。 后續(xù)操作均在超凈工作臺中進行。取出股骨將兩端剪除，將骨髓腔暴露。骨髓腔用PBS 緩沖液清洗3 遍，室溫下離心（1 000 rpm/min，20 min），棄上清液，加入1 mL 10% FBS-DMEM 完全培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，將其加入培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每隔2～3 d 進行換液。 當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部約80%時可進行傳代操作。

1.2.3 基因轉(zhuǎn)染 取第2～3 代的大鼠BMSCs 進行以下操作。將培養(yǎng)好的BMSCs 消化離心，臺盼藍染色對活細(xì)胞進行計數(shù)。于六孔板每孔中加入密度為1×105/mL的細(xì)胞懸液2 mL， 培養(yǎng)箱中穩(wěn)定過夜， 當(dāng)細(xì)胞達到60%～80%融合， 于轉(zhuǎn)染前1 天棄去原培養(yǎng)基換無血清培養(yǎng)1 d。 按轉(zhuǎn)染試劑操作說明書進行轉(zhuǎn)染。 將細(xì)胞培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)液吸出， 每孔加入200 μL ENI.S， 將病毒稀釋至終濃度為1×1011TU/L， 每孔加入Polybrene 至終質(zhì)量濃度為5 mg/L，孵育12～24 h。 后吸棄液體，加10%FBS-DMEM 完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 ELISA 法檢測bFGF 表達 6 孔板底部預(yù)先鋪好用于免疫熒光檢測的玻片， 于每孔中鋪入密度為1×105/mL 的轉(zhuǎn)染bFGF 后的BMSCs 作為轉(zhuǎn)染組，每孔加入2 mL。分別于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h分別提取1 mL 的大鼠BMSCs 培養(yǎng)上清液。在各時間點分別吸取1 mL 上清至事先滅菌并做好標(biāo)記的EP管中 （提取后補加完全培養(yǎng)液1 mL），1 000 rpm/min離心15 min， 吸取上清加入新EP 管中， 編號后于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?利用ELISA 檢測bFGF 蛋白表達，試劑應(yīng)按瓶上標(biāo)簽說明儲存，使用前室溫平衡。對照組接種的細(xì)胞為未處理的BMSCs。后續(xù)操作參照ELISA 試劑盒說明進行。

1.2.5 免疫熒光方法檢測 將ELISA 實驗中事先鋪好的蓋玻片取出，PBS 緩沖液清洗3 次，4%多聚甲醛液固定15 min 后，再次清洗；1%牛血清白蛋白封閉30 min，按照說明書對抗體進行稀釋， 加入稀釋后的一抗bFGF 孵育100 min， 重復(fù)清洗；1%BSA 封閉30 min；加二抗孵育40 min 后清洗；DAPI 復(fù)染細(xì)胞核后清洗并封片。 操作時注意避光。

1.2.6 免疫組化染色 將BMSCs 涂片用多聚甲醛中固定30 min，封閉，加入山羊血清50μL 室溫孵育20min。再加入稀釋后的bFGF 一抗100 μL 于37℃孵育2 h，再加入通用型IgG 抗體-Fab 段-HRP 多聚體50 μL室溫孵育30 min。 DAB 溶液顯色，復(fù)染，脫水，封片后于顯微鏡下觀察。 以轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒為正常組，以未轉(zhuǎn)染為陰性組。染染效率=（bFGF 表達陽性的細(xì)胞數(shù)/計數(shù)細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.2.7 CCK-8 法測增殖活性 將轉(zhuǎn)染后的BMSCs 重懸成5×103/mL 的細(xì)胞懸液以每孔100 μL 的體積種到96 孔板中作為轉(zhuǎn)染組。 培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)24 h 后用CCK-8 試劑檢測細(xì)胞增殖能力的變化。 取出96 孔板， 以每孔10 μLCCK-8 的體積加入96 孔板中后繼續(xù)孵育2 h。 后將96 孔板置于酶標(biāo)儀中在波長450 nm處讀取吸光度值（A），6 個復(fù)孔的平均值用來表示測量結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs 的體外培養(yǎng)

在培養(yǎng)24 h 后大鼠BMSCs 開始貼壁，逐漸開始伸展呈長梭形或者三角形，并出現(xiàn)小集落樣生長，d9～11 可鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%左右。 經(jīng)臺盼藍染色得活細(xì)胞比率約為97%。 計算細(xì)胞倍增時間約為53.6 h。通過生長曲線可知原代大鼠BMSCs 的生長期緩慢，隨后進入對數(shù)生長期并在d7～9 內(nèi)持續(xù)旺盛的增殖，并轉(zhuǎn)入平臺期，增殖活力與對數(shù)生長期相交減緩并趨于穩(wěn)定。 經(jīng)bFGF 轉(zhuǎn)染后BMSCs 的增殖活性被進一步活化，細(xì)胞倍增時間減少，縮短至48.3 h，使細(xì)胞的增殖能力增加，細(xì)胞形態(tài)增大。

2.2 培養(yǎng)上清液中bFGF 濃度的測定

在不同時間點取培養(yǎng)上清，ELISA 法檢測其中bFGF 的分泌水平。 在60 h 時可達到最高分泌濃度，累計可達到(19.702±0.074)ng/mL，其后隨著時間增加而濃度有所下降，見表1。

2.3 免疫熒光法檢測bFGF 表達

利用免疫熒光染色對BMSCs 不同時間點表達bFGF 情況進行觀察， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胞漿中出現(xiàn)較多的棕黃色顆粒，表明胞漿中有bFGF 的存在，并隨著時間推移逐漸增加，60 h 時含量最多，隨后逐漸減少，而這種濃度的變化趨勢大致類似于ELISA 法中檢測的bFGF 變化趨勢。 而空白組則無明顯的染色。

2.4 免疫組化檢測bFGF 表達

鏡下可見轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達bFGF 呈陽性，其表達部位在胞漿，細(xì)胞胞漿染成黃褐色。 轉(zhuǎn)染組bFGF 表達率最高可達為(72.19±8.83)%， 對照組陽性表達率為(19.82±2.54)%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組bFGF 在大鼠BMSCs 中的表達比較[（±s），%]

表2 兩組bFGF 在大鼠BMSCs 中的表達比較[（±s），%]

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別陽性率對照組轉(zhuǎn)染組t 值P 值19.82±2.54（72.19±8.83）*9.872＜0.05

2.5 CCK-8 法測大鼠BMSCs 增殖活性

轉(zhuǎn)染后的和為轉(zhuǎn)染的大鼠BMSCs 分別以每孔5×103的密度接種于96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h 后，CCK-8 法檢測其增殖活性。 與空白組相比，轉(zhuǎn)染組能顯著促進HUVEC 細(xì)胞增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

3 討論

表1 兩組大鼠BMSCs 不同時間點bFGF 分泌水平比較[（±s），ng/mL]

表1 兩組大鼠BMSCs 不同時間點bFGF 分泌水平比較[（±s），ng/mL]

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別對照組轉(zhuǎn)染組P 值t 值12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h 0.284±0.161(3.522±0.324)*9.633×10-5 15.501 0.593±0.215(5.991±0.323)*0.002 24.096 1.058±0.332(8.419±0.115)*2.965×10-6 36.146 1.977±0.123(13.014±0.313)*7.390×10-7 56.844 1.080±0.252(19.702±0.074)*7.883×10-7 122.808 0.534±0.098(11.935±0.203)*1.292×10-7 87.556

ICM 屬于冠心病的晚期階段，由于心肌缺血而引發(fā)的心力衰竭、心臟擴大的臨床癥狀，其主要臨床表現(xiàn)為心絞痛、心力衰竭、心律失常、血栓和栓塞，勞力性呼吸困難等[5]。 ICM 對人類健康和生活帶來嚴(yán)重影響，其發(fā)病率和致死率持續(xù)增加[6]。該實驗旨在探究體外培養(yǎng)大鼠BMSCs 后用病毒攜帶bFGF 轉(zhuǎn)染細(xì)胞，觀察其生物學(xué)功能的變化， 為臨床ICM 的治療提供新思路。

BMSCs 首先由Friedens tein 等于1986 年提出的具有分化成多種細(xì)胞潛能及自我更新能力的一類干細(xì)胞。 因其具有的分化潛能，通過控制特定的誘導(dǎo)條件，使BMSCs 向骨、肌腱、肌肉或關(guān)節(jié)等多種組織進行分化[7]。 當(dāng)機體存在損傷區(qū)時，四周的BMSCs 可遷移至該區(qū)域，促進受損區(qū)域的修復(fù)或愈合。目前，基因水平的治療方案隨著基因工程技術(shù)的快速發(fā)展，被廣泛應(yīng)用于在組織工程。而BMSCs 因其來源范圍廣，易得取、分離、培養(yǎng)和增殖，多向分化潛能，易實現(xiàn)自體移植， 減少異體移植的排斥反應(yīng)的低或無免疫源性，易于被外源基因轉(zhuǎn)染并穩(wěn)定表達等優(yōu)點，已成為轉(zhuǎn)基因技術(shù)種子細(xì)胞的首選， 然而移植后BMSCs 存活率過低的問題一直未被解決[8]。 為解決該問題相關(guān)研究工作者進行了大量的研究， 結(jié)果證實低傳代接種密度、 低糖培養(yǎng)基和bFGF 的使用均能夠促進BMSCs的增殖[9]。 因此，在該實驗中，選取bFGF 基因?qū)MSCs 進行轉(zhuǎn)染。 獲取BMSCs 的方法主要包括全骨髓培養(yǎng)法、密度梯度離心結(jié)合貼壁培養(yǎng)法及流式細(xì)胞術(shù)分離法。 王雪[10]利用離心法結(jié)合貼壁培養(yǎng)法獲取了大量的可傳代的原代BMSCs， 經(jīng)流式細(xì)胞儀的檢測CD44 陽性表達率高達99.96%，其結(jié)果與該研究一致，說明離心法結(jié)合貼壁法可用于原代BMSCs 的提取，而在該實驗中以此方法進行BMSCs 的提取且提取的BMSCs 經(jīng)鑒定純度均大于99.9%可用于后續(xù)實驗。

成纖維細(xì)胞生長因子 （fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）是由內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等多種細(xì)胞分泌，有酸性和堿性兩種形式，同分異構(gòu)體多樣，對多種細(xì)胞游走或增殖等生物學(xué)功能，血管新生，受損細(xì)胞的修復(fù)如軟骨與骨的愈合等均具有促進作用，在機體的創(chuàng)傷愈合或肢體再生中發(fā)揮重要作用[11]。 FGF可以加速病灶的產(chǎn)生，但從修復(fù)角度看它也有有利的一面。 FGF 具有促進細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)細(xì)胞的形態(tài)改變和分化的作用，在生理或病理狀態(tài)下都能夠參與機體的生長發(fā)育和組織損傷的修復(fù)過程。 bFGF 是FGF 重要組成部分，對來源于中胚及神經(jīng)外胚層細(xì)胞的增殖能力具有促進作用的細(xì)胞分泌物質(zhì)。 bFGF 對于BMSCs、血管內(nèi)皮細(xì)胞或成骨細(xì)胞等的增殖，抑制其分化成熟，分裂及修復(fù)具有不可替代的作用。 bFGF對在極底的濃度時（低至1 ng/mL）中對胚層及神經(jīng)外胚層來源的細(xì)胞任然具有強大的的促有絲分裂作用[12]，能加快BMSCs、成纖維細(xì)胞等的分裂，增殖和分化能力，因此其在組織愈合及修復(fù)中具有巨大的潛能。 研究發(fā)現(xiàn)濃度為1 ng/mL 的bFGF 可抑制肌肉細(xì)胞分化，抑制率可達49%，當(dāng)bFGF 濃度增加至10 ng/mL時，抑制率高達80%[13]。 該實驗中bFGF 的表達隨著時間的增加含量逐漸增多， 并在60 h 累計含量達到最高，可達(19.702±0.074)ng/mL，其最低分泌濃度均>1 ng/mL，說明將其轉(zhuǎn)染入BMSCs 后能夠有效促進其增殖及分化。

表3 兩組大鼠BMSCs 不同時間點細(xì)胞增殖活性變化情況比較[（±s），%]

表3 兩組大鼠BMSCs 不同時間點細(xì)胞增殖活性變化情況比較[（±s），%]

注：與對照組相比，*P＜0.05

組別12 h 24 h 36 h 48 h 60 h 72 h對照組轉(zhuǎn)染組P 值t 值100.4±0.2（104.1±0.9）*0.002 6.951 101.9±1.5（109.8±0.5）*0.001 8.654 102.6±0.4（113.5±1.1）*8.6422×10-5 16.130 105.6±1.1（118.9±0.8）*7.126×10-5 17.342 102.7±1.0（124.3±1.2）*0.000 23.951 101.3±0.3（113.8±1.5）*0.000 14.153

病毒載體對分裂期及非分裂期細(xì)胞均具有感染作用，能使目的基因進入靶細(xì)胞并能夠穩(wěn)定長期得表達，可向同一細(xì)胞引入多種基因，或?qū)ν患?xì)胞進行對此轉(zhuǎn)染，不易引起靶細(xì)胞的免疫反應(yīng)，生物學(xué)安全性也較高。 該實驗采用病毒轉(zhuǎn)染的方法操作簡單，目的基因的表達在一定的時間內(nèi)保持穩(wěn)定的表達。選用bFGF 基因，通過病毒轉(zhuǎn)染的方法，轉(zhuǎn)染入BMSCs 中[14]。該實驗研究發(fā)現(xiàn)采用病毒介導(dǎo)的bFGF 基因轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs， 可在特定的時間段內(nèi)持續(xù)并大量的分泌出bFGF，通過ELISA 法在12 h 即可檢測到bFGF 的表達并隨著時間的增加含量逐漸增多，并在60h 累計含量達到最高，可達(19.702±0.074)ng/mL，之后隨著時間的延長bFGF 的分泌量隨之減少，在72 h 可降低至(11.935±0.203)ng/mL， 但其分泌量均大于其最低有效濃度，即1 ng/mL，結(jié)果說明轉(zhuǎn)染在72 h 內(nèi)均能保持較強的促進BMSCs 增殖的作用， 但是隨著時間的延長其分泌量逐漸減少， 故其促增殖作用也將逐漸減弱，應(yīng)在一定時間內(nèi)完成相關(guān)實驗，到達時間后需對細(xì)胞重新進行轉(zhuǎn)染，且轉(zhuǎn)染后作用的持續(xù)時間需進一步延長。 免疫組化結(jié)果證實bFGF 在BMSCs 中高表達且其在胞漿部位表達，說明bFGF 病毒轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，能在BMSCs 中得到正確而高效的表達，其中轉(zhuǎn)染的效率最高可達(72.19±8.83)%，說明大鼠BMSCs 轉(zhuǎn)染bFGF 基因的效率較高，具體實施具有一定的可行性。 與人BMSCs 的轉(zhuǎn)基因效率約為(19±1.3)%相比較[15]，轉(zhuǎn)染效率有明顯增加，增加了其作為心肌缺血疾病治療的靶細(xì)胞的可操作性。 但與張槐等[16]實驗中表達成功率達90% 以上相比較，轉(zhuǎn)染率較低，分析可能是因為轉(zhuǎn)染時的濃度或操作不熟練等問題造成，在后期實驗中將進行改進。 同時，大鼠BMSCs 轉(zhuǎn)染bFGF 基因后生長曲線也隨之變化，細(xì)胞倍增時間由53.6 h 縮短為48.3 h，細(xì)胞分裂相增多，推測其可能的原因為物種間不同而產(chǎn)生的差異。 與人BMSCs 倍增時間42.4 h 相比，差異性較小。 并隨著bFGF 表達的增加，導(dǎo)致BMSCs 的增殖活性的增加，增殖率可增加至(124.3±1.2)%， 并且可導(dǎo)致其形態(tài)的改變， 在bFGF 轉(zhuǎn)染組中， 細(xì)胞增殖分裂能力明顯強于空病毒組與未轉(zhuǎn)染組，該結(jié)果與張槐等人[16]結(jié)果一致，證明空病毒組無顯著增加BMSCs 的能力， 可能是bFGF 促進了BMSCs 的增殖有關(guān)。 與人BMSCs 的96%相比較而言，增殖活性明顯提高，推測可能與bFGF 分泌量相關(guān)。 因此推測對缺血的心肌組織內(nèi)植入基因修飾后的BMSCs，有望其在機體內(nèi)分泌較高含量的bFGF， 從而在特定時間段內(nèi)發(fā)揮促進細(xì)胞增殖及分化等生物效應(yīng)。此外，還可促進BMSCs 的分化成心肌組織的能力，將其作為心肌缺血疾病治療的靶細(xì)胞，在將來有望成為治療ICM 有效的治療方法。

綜上所述，通過病毒轉(zhuǎn)染的方法，成功將具有多重生物學(xué)效應(yīng)的bFGF 基因轉(zhuǎn)染入大鼠BMSCs。轉(zhuǎn)染后的大鼠BMSCs 可在較長時間內(nèi)保持較高濃度的bFGF 的分泌。 bFGF 基因轉(zhuǎn)染可促進大鼠BMSCs 的增殖和分化。因此，心肌基因的治療可將BMSCs 作為靶細(xì)胞，將bFGF 轉(zhuǎn)染入其中并保持長時間的分泌水平以促進BMSCs 增殖，在將來有望作為IBM 強有力的治療手段。