周凌，宣偉軍，丁大連

(1. 黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科,哈爾濱 150040； 2. 廣西中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院 耳鼻咽喉科, 南寧 530023； 3. 馬薩諸塞州總醫(yī)院, 哈佛大學醫(yī)學院，波士頓 MA 02114, 美國； 4. 聽力與耳聾中心，紐約州立布法羅大學，布法羅 NY 14214, 美國)

老年性聾又稱年齡相關性聾(age-related hearing loss, AHL)，隨著世界人口的老年化， AHL的發(fā)病率也逐年遞增[1]。 AHL因其病因病機復雜和防治困難， AHL成為當前耳科學研究的重要熱門課題之一[2-4]。由于在AHL的臨床研究中較難開展組織細胞水平或蛋白水平或基因水平等分子層面的實驗研究，因此目前對AHL的組織細胞學及更微細結構的研究大多還是借助動物實驗模型。在諸多哺乳類實驗動物模型中，由于小鼠的生命周期相對較短而且目前已成功建立起多種AHL相關基因缺陷的小鼠實驗模型，因此AHL小鼠模型中的CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠得到更多的應用。CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠最早是由美國Jackson Laboratory于上世紀四十年代引入通過近交培育出的、具有遺傳基因純合、個體差異小、對試驗反應均一、試驗結果更準確和更可靠等特點的兩個鼠種，并維持應用至今。然而，這兩種較常用小鼠模型的耳蝸毛細胞損害規(guī)律及發(fā)展模式卻并不相同[5-6]。本文應用全耳蝸基底膜鋪片技術和耳蝸圖制備技術，對出生后不同年齡的CBA/CaJ小鼠和C57BL/6J小鼠的全耳蝸毛細胞進行了精確的定位定量觀察，并將兩種不同小鼠的耳蝸毛細胞病理學改變進行了對比分析及討論。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗動物為清潔級CBA/CaJ和C57BL/6J成年小鼠各32只，雌雄各半，年齡分別在6個月、12個月、18個月和24個月，每個年齡組各8只，由美國國家核準認定的標準實驗動物源提供機構、國際標準CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠培育基地Jackson Laboratory(https:/www.jax.org/strain)提供,其mouse strain datasheet-stock No.分別是000654、000664，均飼養(yǎng)于獲得美國官方嚴格認證的美國紐約州立布法羅大學(State University of New York at Buffalo)實驗動物中心。研究項目獲得美國相關部門嚴格審查和批準開展。

1.1.2 試劑及儀器

主要實驗試劑Hematoxylin Solution, Harris Modified(Sigma-Aldrich，產品號HHS16)，Potassium dihydrogen phosphate(Sigma-Aldrich，產品號NIST200B)，Disodium hydrogen phosphate(Sigma-Aldrich，產品號NIST218611)，Sodium succinate dibasic hexahydrate(Sigma-Aldrich，產品號S2378)，Tetranitroblue tetrazolium chloride(Sigma-Aldrich，產品號T4000)，Xylenes(Sigma-Aldrich, 產品號是XX0060)。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸標本制備與鋪片

在麻醉狀態(tài)下，牽引小鼠頸部造成頸椎脫位，然后開顱取出小鼠顳骨。在解剖顯微鏡下，在蝸尖鉆孔并摘除鐙骨同時打開園窗，向耳蝸內灌入4%甲醛固定液并固定24 h以上，再經5%鹽酸溶液脫鈣48 h后，分離取出全耳蝸基底膜，逐級遞減梯度乙醇水化，蘇木素染液常規(guī)對基底膜染色，自來水沖洗返藍，逐級遞增梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后將全耳蝸基底膜移入載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固。或向耳蝸內灌入琥珀酸脫氫酶孵育液，即琥珀酸脫氫酶孵育液由一份0.2 mol/L琥珀酸鈉和一份0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液及兩份0.1%氯化硝基四氮唑藍混合配制而成。將含有琥珀酸脫氫酶孵育液的耳蝸置于37℃恒溫箱內孵育40～60 min，然后將耳蝸浸入10%中性福爾馬林固定液固定24 h以上，前法脫鈣后，分離取出全耳蝸基底膜移入載玻片上的甘油滴中，蓋上蓋玻片，中性樹膠封固[7-9]，顯微鏡下觀察。

1.2.2 耳蝸圖和毛細胞的定位定量分析

在放大400倍的普通光學顯微鏡下，分別對6月齡組、12月齡組、18月齡組和24月齡組的CBA/CaJ小鼠和C57BL/6J小鼠的全耳蝸基底膜進行毛細胞缺損的定位定量觀察。在置有標記單位長度為0.24 mm的顯微測量尺目鏡的光學顯微鏡下，從蝸尖向蝸底逐個視野依次進行內、外毛細胞計數，并將采集的數據輸入到計算機中，分別與耳蝸圖軟件中預先設置的CBA/CaJ小鼠和C57BL/6J小鼠參考數據進行逐一比較，耳蝸基底膜的實際全長被轉換為百分比長度單位，單位長度內的毛細胞實際數量被轉換成毛細胞密度并按照百分比分布在耳蝸基底膜的各個部位，從而建立其該耳蝸的毛細胞缺損分析圖。最后應用本耳蝸圖軟件程序，將每組8個耳蝸的毛細胞缺損分析圖整合成該組動物的平均耳蝸圖[7-9]。另外，將不同區(qū)域的毛細胞密度值摘出，采集數據被輸入到GraphPad Prism 5軟件系統(tǒng)，最后進行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計分析。兩個或多個構成比比較應用卡方(χ2)檢驗法，以P<0.05差異有顯著性。

2 結果

CBA/CaJ小鼠耳蝸圖結果顯示，6月齡全耳蝸內外毛細胞數量完整，未見缺損(圖1a)。12月齡從蝸尖開始至距離蝸尖15%區(qū)域出現(xiàn)外毛細胞缺損，離蝸尖越近缺損越重，最高缺損達到15%。耳蝸底回Hook區(qū)域，即距離蝸尖85%至溝端區(qū)域也有缺損，離底部越近缺損越多，但不如頂部明顯，最高缺損占5%(圖1b)。18月齡耳蝸外毛細胞缺損擴大，從蝸尖開始至距離蝸尖30%區(qū)域均出現(xiàn)外毛細胞缺損，其中從蝸尖至距離蝸尖15%區(qū)域處呈陡降高峰，顯示該區(qū)域缺損最重，最高缺損達到40%，同時向底回方向逐漸減少。耳蝸底回距離蝸尖85%至溝端區(qū)域外毛細胞也有缺損，缺損繼續(xù)擴大，最高達到15%，與耳蝸頂回缺損相反，外毛細胞缺損向底回方向逐漸加重(圖1c)。24月齡全耳蝸各回外毛細胞均有不同程度缺損，比18月齡明顯擴大，其中從蝸尖至距離蝸尖35%區(qū)域處呈陡降高峰，顯示該區(qū)域外毛細胞缺損最重，最高缺損達到70%。距離蝸尖65%至溝端區(qū)域，外毛細胞缺損也對應擴大，最高缺損占30%。耳蝸頂部和底部內毛細胞開始出現(xiàn)缺損，其中距離蝸尖75%至溝端區(qū)域缺損增加，最高可達15%，而頂回有所缺損，最高占5%，比底部輕(圖1d)。CBA/CaJ小鼠不同齡全耳蝸鋪片頂回、底回毛細胞比較鏡下觀察見圖2A1-D2?？傊?，CBA/CaJ小鼠耳蝸毛細胞變化特點是，伴隨著年齡增長，12月齡開始出現(xiàn)耳蝸外毛細胞輕度缺損，遵循著從頂回和底回兩端開始，向中回延伸，但頂回毛細胞損害比底回嚴重的病變規(guī)律。24月齡內毛細胞在頂回和底回兩端開始出現(xiàn)缺損，但損害程度較輕。

注： IHC:內毛細胞平均曲線。OHC1、OHC2、OHC3：第一、二、 三排外毛細胞平均曲線。圖1 CBA/CaJ小鼠不同齡全耳蝸毛細胞計數耳蝸圖Note. IHC: average curve of inner hair cells. OHC1, OHC2， OHC3： average curve of the first, second and third row of outer hair cells.Figure 1 Cochleograms of whole cochlea hair cells count in the CBA/CaJ mice at different ages

C57BL/6J小鼠耳蝸圖結果顯示，6月齡已經出現(xiàn)外毛細胞缺損，以耳蝸底部為主，即從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖75%區(qū)域出現(xiàn)外毛細胞缺損，越往底部越重，最高缺損可達65%，同時從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖85%區(qū)域也出現(xiàn)了內毛細胞的缺損，最高缺損程度可達25%。耳蝸頂部出現(xiàn)外毛細胞缺損較少，從蝸尖開始至距離蝸尖15%區(qū)域出現(xiàn)外毛細胞缺損，離蝸尖越近外毛細胞的缺損數量越多，最高缺損可達20%，但內毛細胞基本完整(圖3a)。12月齡耳蝸底部外、內毛細胞缺損明顯加重，從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖50%區(qū)域都出現(xiàn)了外毛細胞的缺損，最高缺損程度達到100%，同時從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖70%區(qū)域開始出現(xiàn)內毛細胞缺損，最高缺損程度達到55%。與6月齡動物相比，耳蝸頂部外毛細胞缺損變化不大，內毛細胞仍然保持基本完整(圖3b)。18月齡動物耳蝸底部外、內毛細胞缺損繼續(xù)擴大，從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖45%區(qū)域均出現(xiàn)外、內毛細胞缺損，外毛細胞缺損形成陡降高峰，其中從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖70%區(qū)域，外毛細胞的缺損都達到100%，該區(qū)域內毛細胞平均缺損達到50%。耳蝸頂部距離蝸尖30%區(qū)域外毛細胞缺損最高可達40%，但頂部內毛細胞基本完整(圖3c)。24月齡耳蝸外毛細胞缺損基本覆蓋了耳蝸基底膜全程，其中從耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖40%區(qū)域，相當耳蝸底回和中回外毛細胞缺損達到100%，耳蝸頂部距離蝸尖25%以上區(qū)域外毛細胞缺損最高可達80%，距離蝸尖25%至35%區(qū)域外毛細胞缺損最輕，但也達到25%。耳蝸底部溝端開始至距離蝸尖45%區(qū)域，出現(xiàn)內毛細胞大范圍缺損，其中距離蝸尖70%以下區(qū)域的內毛細胞缺損程度平均達到90%，但出現(xiàn)在頂回區(qū)域的內毛細胞缺損僅占10%(圖3d)。C57BL/6J小鼠不同齡全耳蝸鋪片頂回、底回毛細胞比較鏡下觀察舉例見圖4E1-H2?？傊?，C57BL/6J小鼠耳蝸毛細胞變化特點是，伴隨著年齡的增長，6月齡已出現(xiàn)耳蝸外、內毛細胞缺損，并遵循著外毛細胞損害為主和從耳蝸底部開始，逐漸向中回和頂回擴展的病變規(guī)律。

兩個不同鼠種不同齡耳蝸外、內毛細胞平均損失占比經χ2檢驗結果表明(表1)，C57BL/6J小鼠從6月齡開始至24月齡，與同齡CBA/CaJ小鼠比較，外、內毛細胞損失差異具有顯著性意義(P<0.05)，與相同鼠種相鄰觀察年齡段比較，差異也具有顯著性意義(P<0.05)。CBA/CaJ從18月齡至24月齡，與相同鼠種相鄰觀察年齡段外毛細胞缺損比較，差異具有顯著性意義(P<0.05)，24月齡內毛細胞與前個年齡段比較差異也具有顯著性意義(P<0.05)。

注： IHC:內毛細胞平均曲線。OHC1，OHC2，OHC3：第一、二、 三排外毛細胞平均曲線。圖3 C57BL/6J小鼠不同齡全耳蝸毛細胞計數耳蝸圖Note. IHC: average curve of inner hair cells. OHC1, OHC2, OHC3：average curve of the first, second and third row of outer hair cells.Figure 3 Chochleograms of whole cochlea hair cells count in the C57BL/6J mice at different ages

注：E1：6月齡耳蝸基底膜頂回。E2：6月齡耳蝸基底膜底回。F1：12月齡耳蝸基底膜頂回。F2：12月齡耳蝸基底膜底回。 G1：18月齡耳蝸基底膜頂回。G2：18月齡耳蝸基底膜底回。H1：24月齡耳蝸基底膜頂回。H2：24月齡耳蝸基底膜底回。(蘇木素染色，×100)圖4 C57BL/6J小鼠不同齡耳頂回、底回毛細胞比較鏡下觀察舉例Note. E1，Apical turn of cochlear basement membrane at 6 months of age. E2，Basal turn of cochlear basement membrane at 6 months of age. F1，Apical turn of cochlear basement membrane at 12 months of age. F2，Basal turn of cochlear basement membrane at 12 months of age. G1，Apical turn of cochlear basement membrane at 18 months of age. G2，Basal turn of cochlear basement membrane at 18 months of age. H1，Apical turn of cochlear basement membrane at 24 months of age. H2，Basal turn of cochlear basement membrane at 24 months of age. (Hematoxylin stain,×100)Figure 4 Microscopic comparison of hair cells in cochlear apical turn and basal turn of the C57BL/6J mice at different ages

表1 不同齡CBA/CaJ、C57BL/6J小鼠耳蝸外、內毛細胞平均損失百分比X2檢驗結果(百分比：%)Table 1 The results of chi-square test for percentage of average loss of outer and inner hair cells in the cochleae of CBA/CaJ and C57BL/6J mice at different ages(Percentage:%)

注： 兩個不同鼠種同齡同屬細胞比較,*P<0.05。相同鼠種該年齡與上年齡同屬細胞比較,△P<0.05。

Note. Comparisons in the same genus cells of two different species at the same age,*P< 0.05. Comparisons between the age and last age in the same genus cells of the same species,△P<0.05.

3 討論

人類AHL因發(fā)病隱匿并呈漸進性發(fā)展，病程長，不易觀察，一直是臨床研究難題，其中如何進行耳蝸細胞形態(tài)學臨床研究更是研究的瓶頸，因此，如何選擇合適的動物模型研究和認識AHL細胞形態(tài)學及其發(fā)展變化規(guī)律，并由此為基礎研究分子通路機制、藥物干預作用，一直以來成為耳科界探索熱點，而觀察、研究和比較耳蝸基底膜全程的毛細胞密度則是揭示研究AHL細胞形態(tài)學及其發(fā)展變化規(guī)律的關鍵，并為尋找合適的實驗動物模型提供可參考實驗依據。耳蝸圖軟件可以對全耳蝸毛細胞密度、毛細胞丟失、耳蝸長度進行精準定位定量分析，為全面、完整、正確評估耳聾研究提供了一個重要的研究方法和手段，目前應用耳蝸圖對全耳蝸毛細胞定位定量的評估方法已成為國際各權威耳科研究機構普遍采用的常規(guī)標準[7-9]。哺乳類動物耳蝸聽覺反應的特點是不同頻率聲波信號在基底膜上不同部位形成最大的振動幅度，從而可以選擇性刺激該頻率共振特定部位的毛細胞。一般來說，耳蝸底回的毛細胞感應高頻聲音刺激信號，而耳蝸頂回毛細胞則只對低頻聲音刺激起反應，由于耳蝸基底膜上不同部位的毛細胞只對特定頻率的聲音刺激起最大反應，因此沿著耳蝸基底膜的全長便形成了一個重要的耳蝸頻率位置對應關系。不同物種動物的耳蝸基底膜長度和聽覺頻率范圍并不相同，例如人類的耳蝸基底膜長度大約在35 mm左右，其可聽頻率范圍一般被認為是從20～20 000 Hz；大鼠的耳蝸基底膜長度大約在9 mm左右，其可聽頻率范圍是從1000～90 000 Hz；小鼠的耳蝸基底膜程度大約在6 mm左右，其可聽頻率范圍是從1000～100 000 Hz。因此，耳蝸基底膜對應不同頻率感應區(qū)的位置在不同種類的實驗動物也不相同。由于實驗動物的耳蝸圖制備包含著該種類動物的耳蝸基底膜總長度和基底膜上每個不同位點的不同毛細胞密度及其對應的音頻反應位置等重要信息，因此耳蝸圖成為精準評估各種實驗動物全耳蝸毛細胞病理學改變并對應其聽覺功能障礙的最可靠研究方法之一[7]。

由于豚鼠壽命長，平均約在5年左右，以豚鼠作為研究老年性內耳損害模型，需要等待若干年直到動物進入老年，因此不易觀察和研究。而小鼠生命周期短，尤其是有的特殊基因缺陷型小鼠能夠提早發(fā)生AHL，因此國際針對AHL研究，更多傾向于采用小鼠AHL模型。研究發(fā)現(xiàn)，不同種株近交系小鼠耳蝸毛細胞的退變隨著年齡的增長存在著截然不同的病變發(fā)生時間和病理學改變進程[7,10]。用于研究AHL動物模型較多的是CBA/CaJ和C57BL/6J小鼠。然而，通過聽力學研究表明，在成年早期，CBA/CaJ并沒有表現(xiàn)AHL，而C57BL/6J小鼠出現(xiàn)AHL較早，但在后期CBA/CaJ同樣也出現(xiàn)AHL[11]。本次通過耳蝸圖毛細胞密度、定位定量分析也證實，6月齡C57BL/6J小鼠耳蝸基底部毛細胞已出現(xiàn)損失，但同齡CBA/CaJ小鼠幾乎未見變化，至18月齡僅外毛細胞才出現(xiàn)具有統(tǒng)計學意義的時間可比性損失變化，但相較C57BL/6J小鼠，損失不多，而同齡C57BL/6J小鼠耳蝸外毛細胞損失過半，內毛細胞也損失幾乎1/3，之后隨著年齡老化，CBA/CaJ小鼠耳蝸毛細胞損失迅速增加。這些毛細胞退變和損失變化與前述文獻報道的兩種小鼠聽力學改變一致。兩種不同屬性小鼠不同時間出現(xiàn)AHL，與它們的基因遺傳學密切相關，C57BL/6J小鼠存在隱性等位基因改變，CBA/CaJ小鼠則沒有[10]。為了探明C57BL/6J小鼠存在的隱性等位基因改變，通過對C57BL/6J小鼠Sod1(+/+)Cdh23(ahl/ahl)、Sod1(+/+)Cdh23(+/+)、Sod1(-/-)Cdh23(ahl/ahl)、Sod1(-/-)Cdh23(+/+)四種基因型ABR(auditory brainstem-evoked response)聽力檢測研究發(fā)現(xiàn)， Sod1(+/+)Cdh23(+/+)小鼠在15個月齡前仍保持正常聽力，其中Sod1(-/-)Cdh23(ahl/ahl)小鼠表現(xiàn)出聽力損失最早而且發(fā)病最嚴重，其次是Sod1(+/+)Cdh23(ahl/ahl)、Sod1(-/-)Cdh23(+/+), 由此認為，Cdh23(ahl/ahl)基因缺陷型是導致C57BL/6J小鼠早期即出現(xiàn)AHL病變的主要原因[12-13]。進一步研究顯示，C57BL/6J小鼠與CBA/CaJ小鼠不同，在于C57BL/6J隱性Cdh23等位基因(ahl)在純合子時對AHL的易感性增加，而CBA/CaJ是顯性等位基因(Ahl+)則具有對AHL不易感性，通過對3個月、6個月、9個月、12個月、15個月和18個月齡時測量8 kHz、16 kHz和32 kHz純音刺激的ABR閾值比較，C57BL/6J小鼠32 kHz ABR閾值在6月齡時明顯高于CBA/CaJ小鼠，其16 kHz閾值在12個月齡時顯著高于CBA/CaJ小鼠。這些結果表明，CBA/CaJ衍生的Cdh23(ahl+)等位基因在其他C57BL/6J遺傳背景下可顯著減少聽力損失和毛細胞死亡，但C57BL/6J小鼠衍生的cdh23(ahl)等位基因對其他CBA/CaJ背景下的聽力損失影響不大[14]。最新針對cdh23基因，利用C57BL/6 NJ和129S1/SvImJ胚胎干細胞并使用互聯(lián)單堿基對替換(B6-Cdh23C.753A>G和129S1-Cdh23C.753G>A)，進行同源重組設計小鼠種株，對與許多近交系鼠共同的鈣粘蛋白23基因(Cdh23C.753A)的單核苷酸變體(SNV)進行研究，通過檢測ABR閾值和耳蝸病理學觀察，對這些SNV小鼠同源B6.129S1-Cdh23Ahl+與129S1.B6-Cdh23ahl和親源(B6N和129S1)進行了比較，結果證實，Cdh23C.753G等位基因對C57BL/6J小鼠至少18個月齡的高頻聽力損失具有保護作用，而Cdh23C.753A等位基因的AHL誘導作用加重了129S1小鼠的聽力損失。兩個同源小鼠的ABR閾值不同和互聯(lián)回交導致差異原因是定位于 Chr 10 QTL。這些結果說明了種株背景和同源區(qū)相關聽力損失影響與Cdh23C.753等位基因變異有關，即Cdh23C.753A的SNV,可加速AHL，并可惡化其他突變的聽覺表型[15]。

綜上所述，C57BL/6J小鼠青年時期即可出現(xiàn)與年齡相關的毛細胞損失并由此導致AHL的主要原因是Cdh23基因的缺失，而CBA/CaJ小鼠青年時期尚未出現(xiàn)毛細胞損失并由此導致AHL的主要原因正是因為其具有顯性Cdh23基因。因此，CBA/CaJ小鼠所表現(xiàn)出的發(fā)生較晚的年齡相關聽覺障礙似乎可以被認為是一種天然發(fā)生的AHL動物模型。于此不同的是，C57BL/6J小鼠存在著Cdh23ahlAHL等位基因片段的缺失，在這種小鼠身上發(fā)生的較早聽覺衰退被多數人贊同的看法似乎更像是與遺傳基因缺陷有關。以往我們的研究，主要以C57BL/6J小鼠作為AHL動物模型，是利用其早期即出現(xiàn)AHL，便于短期觀察的特點[6,16-17]。但C57BL/6J小鼠畢竟屬于基因變異種株，相比之下，CBA/CaJ小鼠更接近自然形成的AHL，其導致AHL病理機制與C57BL/6J異同點，有待進一步探討和揭示。