梁志康，馮靜雯，謝保勝

(1. 青海大學昆侖學院， 西寧 810016； 2. 高原生態(tài)與農業(yè)國家重點實驗室，青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院,西寧 810016)

70年代，Giullemin和Schall先后在綿羊和豬的下丘腦中分離提純促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone，TRH)，該激素是由焦谷氨酸-組氨酸-脯氨酞胺組成的一類神經多肽分子[1]。促甲狀腺激素釋放激素在中樞神經系統(tǒng)的腦部、垂體、脊髓和甲狀腺等均有表達，且該基因序列在脊椎動物中具有保守性[1]。除了對腦垂體的調節(jié)作用外，對神經系統(tǒng)具有保護和促進生長的作用[2]、對皮膚的新皮生成和抑制腸道胃酸的分泌等均有作用[3]；此外，在器官和組織上生長、分化和代謝方面也有影響[4]。而促甲狀腺激素釋放激素在青海湖裸鯉的研究尚未發(fā)現(xiàn)報道，尤其是在裸鯉胚胎發(fā)育中的TRH基因表達水平的研究更未提及。為此，對青海湖裸鯉胚胎的TRH基因的原位雜交進行了研究，分析其表達部位和表達時期的時空特點，獲得TRH基因在青海湖裸鯉的發(fā)育相關表達的初步研究，為以后進一步研究青海湖裸鯉的細胞與發(fā)育生物學提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

實驗用青海湖裸鯉及其胚胎由青海湖裸鯉救護中心剛察縣孵化站提供(青海，剛察)。親魚采自沙柳河野生健康的成年青海湖裸鯉，室外人工授精，孵化車間進行孵化，孵化水溫11～13℃。1～11 d胚胎用4%的多聚甲醛固定48 h，置于-20℃保存,用于整胚原位雜交，參照文獻[5-6]進行操作。成年魚麻醉取腦組織至于凍存管后，立刻放液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑與儀器

Takara MiniBest Universal RNA Extraction Kit試劑盒(Takara)、primerscritTMⅡ1st strand cDNA synthesis kit試劑盒(Takara)、Green Taq mix試劑盒(Vazyme)、DNA純化試劑盒(Takara)、SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒(Sangon Biotech)、T載體PCR產物快速連接試劑盒(Promega)、HM(-)、HM(+)、脫色液、封閉液、顯色液、終止液等。

尼康體視顯微鏡(Nikon SMZ18，日本)、核酸檢測儀(Implen N60，德國)、循環(huán)浴槽(PolyScience，美國)、凝膠成像儀(Uvitec Essential V6，英國)、高速冷凍離心機(Eppendorf，德國)、梯度PCR儀(Eppendorf，德國)、離心機(Sigma，德國)、BG-Power300電泳儀(Baygene，中國)等。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成

從青海大學生態(tài)環(huán)境工程學院青海湖裸鯉轉錄組測序結果得到的TRH基因序列，使用Primer Premier 5.0設計引物，擴增基因片段長度為552 bp，引物序列為TRH-F：5’-GCAGGA CCGAGGT TGTCATGAG-3’；TRH-R：5’-TCCAGTCCTCGCAC AGTCTCTTC-3’。引物合成由生工生物工程(上海)公司完成。

1.2.2 總RNA的提取和cDNA的合成

從液氮中取出腦組織，用組織研磨器(Tiangen)進行研磨，使用Takara MiniBest Universal RNA Extraction Kit提取總RNA，核酸微量儀檢測提取的RNA濃度和純度。

1.2.3 PCR擴增與純化

使用Green Taq mix試劑盒，常規(guī)PCR擴增?；厥諗U增產物并用DNA純化試劑盒純化，檢測回收條帶。

1.2.4 連接、轉化和測序

目的片段與PGEM-T載體鏈接并轉化至DH5α大腸桿菌。LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)，經菌液PCR菌液驗證后測序。

1.2.5 提取質粒

利用SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒提取質粒DNA，檢測質粒的濃度和純度。

1.2.6 制備探針

分析測序結果：TRH基因插入方向為正向，上游引物在T7端，選擇的酶切位點在T7端。將上述提取的重組質粒用Sac Ⅱ酶酶切，用地高辛抗體和SP6 RNA聚合酶制備RNA探針[7]。

1.2.7 原位雜交

雜交第1天：取1～11 d的青海湖裸鯉胚胎各五個至EP管中；復水處理；胰蛋白酶處理胚胎，1～3 d的胚胎不做處理，4～11 d的胚胎蛋白酶K處理時間依次為20、25、30、35、40、45、50、60 min。脫色處理，1～11 d的胚胎脫色液處理時間依次為0.5、1、2、3、4、6、8、10、12、14、16 min。將胚胎放入雜交槽中，加入400 μL預熱的HM(-)，70℃水浴2 h。棄HM(-)，加入500 μL HM(+)與TRH探針混合液。雜交槽避光，70℃水浴過夜。

雜交第2天：回收探針；HM(-)和SSC(檸檬酸鈉緩沖液)處理70℃水浴，避光。在如下梯度洗滌：

100% HM(-)，15 min；75% HM(-)+25% 2 × SSC， 15 min；50% HM(-)+50% 2 × SSC， 15 min；25% HM(-)+75% 2 × SSC， 15 min；2 × SSC， 15 min；0.2 × SSC， 30 min， 2次。

室溫下在慢速搖晃的搖床上進行以下梯度洗滌：

75% 0.2 × SSC+25% PBST， 10 min；50% 0.2 × SSC+50% PBST， 10 min；25% 0.2×SSC+75% PBST， 10 min；100% PBST， 10 min；

各雜交槽中加入封閉液500 μL，2 h后棄封閉液。在雜交槽中加入抗體+封閉液 500 μL，搖床1 h，4℃冰箱過夜。

雜交第3天：吸出抗體+封閉液，快速加入500 mL PBST，搖床10 min；加入500 mL PBST，搖床避光6×15 min；加入500 μL staining buffer，3×5 min顯色；顯色完成后，加入Stopping staining，停止顯色；采集圖像。

圖2 青海湖裸鯉與其他魚類的TRH的氨基酸序列同源性比較Figure 2 Comparison of the homologous alignments of the amino acid sequences of TRH of Gymnocypris przewalskii with that of other Fishes

2 結果

2.1 PCR擴增TRH基因

電泳條帶清晰明亮，與預期條帶552 bp的長度一致。(圖1)

注：M：2000 marker；1，2，3，4，5均為相同的TRH基因PCR產物。圖1 青海湖裸鯉TRH基因的PCR擴增片段Note: M: 2000 marker; 1,2,3,4,5 are PCR products of the same TRH gene.Figure 1 PCR amplification fragments of the TRH gene in Gymnocypris przewalskii

2.2 質粒DNA酶切鑒定結果

用sacⅡ酶酶切TRH基因的質粒后得到的DNA序列，結果顯示條帶單一，檢測濃度滿足制作探針的要求。

2.3 TRH基因的CDS區(qū)分析與同源性比較

DNAstar軟件分析TRH基因CDS為606 bp，編碼201個氨基酸(見圖2)。在NCBI網上比對與其他魚類氨基酸的同源性，并用Clustal X2.1和GeneDoc軟件做同源性比對圖。如圖2所示，裸鯉TRH基因編碼的氨基酸序列與鯉魚(Cyprinuscarpio, XP_018964823.1)、鯽魚(Carassiusauratus, XP_026126278.1)、犀角金線鲃(Sinocyclocheilusrhinocerous, XP_016394563.1)、滇池金線鲃(SinocyclocheilusgrahamXP_016106118.1)、斑馬魚(Daniorerio, NM_001012365.2)的同源性分別為144/187 (77%)、139/187 (74%)、129/187 69%)、117/189 (62%)、105/189 (56%)。提示青海湖裸鯉與鯉魚、鯽魚、犀角金線鲃和金魚的同源性較高；與斑馬魚的同源性較低。

2.4 原位雜交結果

為更準確地證明實驗的反義探針的特異性，用T7制備質粒DNA正義探針，1～11 d的胚胎原位雜交實驗結果顯示大腦和脊髓以及其他各組織均未發(fā)現(xiàn)雜交信號，胚胎淺層和組織深處的顏色均一，無明顯的標記。表明陰性探針不與靶基因產生特異性雜交。用SP6制作反義探針，胚胎原位雜交顯示其間腦、中腦、后腦和髓腦出現(xiàn)陽性雜交信號，且隨著胚胎的發(fā)育，表達點不斷增多，間腦表達效果明顯。表明陽性探針與胚胎的靶基因產生特異性結合，以及TRH基因表達具有時間特異性和空間特異性。(見圖3)

注：1 d： 2細胞期；2 d： 低囊胚期；3 d： 原腸晚期；4 d： 神經胚期；5 d： 視泡形成期；6 d： 尾牙期；7 d： 肌肉效應期 1；8 d： 肌肉效應期 2；9 d： 心臟搏動期 1；10 d： 心臟搏動期 2；11 d： 嗅板期。圖3 原位雜交陽性探針圖(×2)Note. 1 d, Two-cells stage. 2 d, Low blastula stage. 3 d, Late gastrula stage. 4 d, Neurula stage. 5 d, Optic vesicle stage. 6 d, Tail bud stage. 7 d, Somites stage 1. 8 d, Somites stage 2. 9 d, Heart beating stage 1. 10 d, Heart beating stage 2. 11 d, Olfactory placode stage.Figure 3 Positive probe in situ hybridization(×2)

3 討論

青海湖裸鯉胚胎發(fā)育至視泡期之前，沒有觀察到TRH基因雜交信號，可能是由于該時期中樞神經系統(tǒng)尚未發(fā)育完善，處于神經管至腦泡腦的發(fā)育階段。肌肉效應期階段觀察到TRH基因在腦泡腦的間腦部位有較清晰的雜交信號，而在中腦、后腦、髓腦和脊髓處沒有觀察到雜交信號。心臟搏動期至嗅板期階段，間腦、中腦、后腦和髓腦檢測到TRH基因均有表達，間腦的表達量明顯高于其他腦部位。提示TRH基因表達最早時期出現(xiàn)于肌肉效應期，且主要表達部位在間腦，此后在腦組織廣泛區(qū)域均有表達。提示TRH除對垂體有促進作用之外，對其他腦區(qū)可能發(fā)揮神經調質的作用。

TRH作為下丘腦-垂體-甲狀腺(hypothalamus-pituitary-thyroid，HPT)軸的關鍵神經信息分子[8-9]，能夠促進垂體前葉釋放促甲狀腺激素(TSH)，而TSH可促使甲狀腺泡釋放甲狀腺激素(THs)，從而加強機體的基礎代謝。有報道，促甲狀腺激素釋放激素具有廣泛的生物學功能，能夠促進生長激素的分泌，進而促進肌肉的生長以及長骨的生長[10]。張曉娜等[11]也證實了魚類甲狀腺激素對魚類胚胎發(fā)育、仔魚的變態(tài)發(fā)育、提高存活率和促進生長等方面均有作用。青海湖裸鯉在高鹽堿，寒冷的生境中得以生存、生長和繁殖，TRH發(fā)揮著極其重要的調節(jié)作用，該基因在裸鯉胚胎期就得以表達，這更有力地驗證了這一推測。另外，TRH基因在裸鯉中樞神經系統(tǒng)具有時空特異性表達的特點，表明該基因是可作為中樞神經發(fā)育的分子標記物，對進一步研究該基因在裸鯉發(fā)育生物學的特殊作用具有重要意義。青海湖裸鯉與其他鯉科魚類TRH同源性比較得出，TRH蛋白具有一定的保守性。從進化的角度看，青海湖裸鯉的TRH基因突變的程度相對較低，是否存著另外特殊的作用，有待進一步研究。此外，利用RISPR/Cas9技術對青海湖裸鯉TRH基因進行編輯[12]，來進一步驗證該基因對裸鯉生物學功能影響將是我們未來的研究方向。