錢宏梁，潘志強，方肇勤

(上海中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，上海 201203)

中醫(yī)證候表征的量化研究是學術界探索的重要領域，其中，寒熱屬性是中醫(yī)辨別病邪性質、機體的陰陽盛衰及病屬外感或內傷的重要依據(jù)。寒即畏寒怕冷，臨床腎陽不足者可能會出現(xiàn)手足、腰部、膝蓋等部位的發(fā)涼或怕冷；熱即身熱感或體溫升高，臨床陰虛內熱者顏面部易出現(xiàn)潮紅、烘熱或手足心發(fā)熱。由此可見，中醫(yī)證候屬熱性時既有主觀性肌膚發(fā)熱感覺，也會出現(xiàn)客觀上體溫升高體征，體溫升高可以通過溫度計準確刻畫，然而主觀上的肌膚熱感則主要通過患者的陳述獲得，其模糊性不利于證候的準確判別。

隨著紅外熱像技術的成熟與運用，醫(yī)學上已有大量紅外測溫的研究，陳振相等[1]紅外熱像儀對健康人的面部進行了觀測，倪金霞等[2]用紅外熱成像儀研究健康人各臟腑的溫度范圍和能量分布。這些探索給中醫(yī)證候實驗研究提供有益的借鑒，有助于寒熱信息在證候判別中的定量化。當機體處于熱量不足或功能衰減狀態(tài)下，紅外輻射少可能表現(xiàn)出寒證；一旦熱量過?；虼x旺盛時，紅外輻射多則可能呈現(xiàn)類似熱證。如“陽虛則外寒，陰虛則內熱，陽盛則外熱，陰盛則內寒”(《素問·調經論》)所言，紅外熱像技術可以很好地的量化檢測體表寒熱情況作為評價中醫(yī)“陽”盛衰程度的手段非常契合，但在實驗動物證候模型的研究方面鮮有報道。基于本課題組長期對于實驗小鼠的診法和辨證論治方法學的研究[3-5]，本實驗圍繞小鼠的“陽”盛衰程度開展了對典型的糖皮質激素誘發(fā)的藥源性證候模型小鼠的探索，通過紅外熱像技術對小鼠體表頭部最高溫度、體表尾部最低溫度和軀干平均溫度3個溫度指標進行了研究，茲報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

雄性ICR小鼠，SPF級，120只，體質量(18～20)g，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司【SCXK(滬)2013-0016】。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級動物房【SYXK (滬) 2014-0008】。實驗動物倫理審批號：SZY201803012。

1.1.2 試劑與儀器

氫化可的松(hydrocortisone，HY)，白色結晶粉末，分子量362.46，購自國藥集團化學試劑有限公司產品(批號66003632)。醋酸潑尼松龍片(prednisolone)(國藥準字H31020771)、醋酸地塞米松片(dexamethasone)(國藥準字H31020793)均購自上海上藥信誼藥廠有限公司。

ThermaCAM P30型紅外熱像儀器(購自美國FLIR公司)用于檢測體表紅外溫度。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模

小鼠適應性飼養(yǎng)，當小鼠體質量穩(wěn)定至30 g左右，開始實驗。

第一批實驗：40只分為正常對照組、極低劑量(0.33 mg/(kg·bw))氫化可的松組、低劑量(0.66 mg/(kg·bw))氫化可的松組、中劑量(3.3 mg/(kg·bw))氫化可的松組和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))氫化可的松組，每組8只。

第二批實驗：40只分為正常對照組、極低劑量(0.25 mg/(kg·bw))潑尼松龍組、低劑量(0.5 mg/(kg·bw))潑尼松龍組、中劑量(2.5 mg/(kg·bw))潑尼松龍組和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))潑尼松龍組，每組8只。

第三批實驗：40只分為正常對照組、極低劑量(0.0125 mg/(kg·bw))地塞米松組、低劑量(0.05 mg/(kg·bw))地塞米松組、中劑量(0.25 mg/(kg·bw))地塞米松組和高劑量(1.25 mg/(kg·bw))地塞米松組，每組8只。

各組按照相應的藥物劑量灌胃，每天1次，連續(xù)14 d；正常對照組灌胃等體積的滅菌水。

1.2.2 紅外熱像儀檢測小鼠體表溫度的標準化方法

在實驗第14天，檢測各組小鼠體表紅外溫度，具體方法如下：

1)將被檢測的實驗小鼠與紅外熱像儀至于環(huán)境溫度22℃的室內，室內移除其他干擾紅外熱像儀的設備或儀器。

2)開啟紅外熱像儀，設定以下相關參數(shù)：FOV視場23(單位：角秒)，調色板以紅色為主，發(fā)射率e為0.97，相對濕度65%，鏡頭為200 μm近焦鏡頭，手動聚焦。

3)準備一個10 cm × 6 cm面積的泡沫塑料材質平臺供小鼠站立。

4)調整紅外熱像儀鏡頭中心與小鼠側腹部在同一水平，且距離60 cm。

5)將小鼠置于泡沫塑料材質平臺上。

6)調整焦距使得小鼠側面輪廓清晰并使其處于紅外熱像儀圖像中心區(qū)域。

7)等待小鼠調整到較好的姿勢時，拍攝小鼠紅外熱像圖，并保存圖片。

1.2.3 小鼠體表紅外溫度的評價指標建立

采用ThermaCAM Reporter 2000專業(yè)版軟件對小鼠紅外熱像圖進行數(shù)據(jù)分析。通過軟件采集三個溫度指標進行分析：

1)頭部最高溫度(即為圖1中A小鼠頭部區(qū)域中的溫度最大值)

2)軀干平均溫度(即為圖1中B小鼠軀干區(qū)域的平均值)

3)尾部最低溫度(即圖1中C小鼠尾根部區(qū)域可以選取到的最小值)。

圖1 小鼠紅外熱像圖分析數(shù)據(jù)示意圖Figure 1 Schematic diagram indicating the three sites of infrared thermogram analysis data of a mouse

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 氫化可的松對小鼠不同部位紅外溫度影響(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，氫化可的松給藥14 d后，不同劑量氫化可的松組小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均出現(xiàn)不同程度的下降。其中極低、低、中、高劑量組小鼠頭部最高溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；極低、低、中、高劑量組小鼠軀干平均溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；極低、低、中、高劑量組小鼠尾部最低溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01),見圖2。

2.2 潑尼松龍對小鼠不同部位紅外溫度影響(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，潑尼松龍給藥14 d后，極低劑量潑尼松龍組小鼠頭部最高溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.05)，軀干平均溫度和尾部最低溫度未出現(xiàn)顯著差異；低、中、高劑量潑尼松龍組小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均未出現(xiàn)顯著差異，見圖3。

2.3 地塞米松對小鼠不同部位紅外溫度影響(陽盛衰程度)

與正常對照組比較，地塞米松給藥14 d后，不同劑量地塞米松組小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均出現(xiàn)不同程度的下降。其中低、中、高劑量小鼠頭部最高溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；低、中、高劑量組小鼠軀干平均溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)；低、中、高劑量組小鼠尾部最低溫度出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，見圖4。

注：不同劑量氫化可的松：極低劑量(0.33 mg/(kg·bw))、低劑量(0.66 mg/(kg·bw))、中劑量(3.3 mg/(kg·bw))和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))。與正常對照組比較，*P<0.05；**P<0.01。另“氫可”即氫化可的松。圖2 氫化可的松小鼠紅外熱圖以及數(shù)據(jù)柱狀圖Note. Different doses of hydrocortisone: very low dose (0.33 mg/(kg·bw)), low dose (0.66 mg/(kg·bw)), medium dose (3.3 mg/(kg·bw)) and high dose (12.5 mg/(kg·bw)). Compared with the normal control group,* P<0.05;** P<0.01.“HY” means hydrocortisone.Figure 2 Infrared heat map and data histogram of the hydrocortisone-treated mice

注：不同劑量潑尼松龍：極低劑量(0.25 mg/(kg·bw))、低劑量(0.5 mg/(kg·bw))、中劑量(2.5 mg/(kg·bw))和高劑量(12.5 mg/(kg·bw))。另“潑松”即潑尼松龍。圖3 潑尼松龍小鼠紅外熱圖以及數(shù)據(jù)柱狀圖Note. Different doses of prednisolone: very low dose (0.25 mg/(kg·bw)), low dose (0.5 mg/(kg·bw)), medium dose (2.5 mg/(kg·bw)) and high dose (12.5 mg/(kg·bw)). “PL” means prednisolone.Figure 3 Infrared heat map and data histogram of the prednisolone-treated mice

注：不同劑量地塞米松：極低劑量(0.0125 mg/(kg·bw))、低劑量(0.05 mg/(kg·bw))、中劑量(0.25 mg/(kg·bw))和高劑量(1.25 mg/(kg·bw))。另“地米”即地塞米松。圖4 地塞米松小鼠紅外熱圖以及數(shù)據(jù)柱狀圖Note. Different doses of dexamethasone: very low dose (0.0125 mg/(kg·bw)), low dose (0.05 mg/(kg·bw)), medium dose (0.25 mg/(kg·bw)) and high dose (1.25 mg/(kg·bw)). “DXM” means dexamethasone.Figure 4 Infrared heat map and data histogram of the dexamethasone-treated mice

3 討論

3.1 紅外熱像技術簡介

紅外熱像儀利用物體的紅外輻射把熱能轉換成電信號，再掃描成像，然后通過軟件可以實現(xiàn)對圖像任何點或區(qū)域的溫度精確分析。由于紅外熱像技術具有非接觸性測溫、測溫速度快、以熱分布圖像直觀呈現(xiàn)等諸多優(yōu)點[6]，其在軍事領域、高壓電網(wǎng)工業(yè)及農業(yè)等領域被廣泛運用[7]。近幾十年來，紅外熱像技術在醫(yī)療診斷、腫瘤研究、疼痛研究、神經定位、針刺效應及人體異常信息的無創(chuàng)監(jiān)測等領域得到廣泛的應用。

3.2 紅外熱像技術在中醫(yī)藥證候研究中的實踐

由于寒熱屬性是中醫(yī)證候的重要特性，雖然臨床表現(xiàn)并非所有的“陽”盛衰證候都有體表溫度的變化，但體表溫度下降是陽虛的基礎見證。近年來，有報道紅外熱像儀在中醫(yī)證候的量化研究方面進行了嘗試，陳振相等[1]用紅外熱像儀對健康人的面部進行了觀測，發(fā)現(xiàn)面部諸臟腑面部反映區(qū)的紅外輻射量有所差異。劉黎青等[8]應用紅外熱像技術觀察不同中醫(yī)辨證分型的紅外舌圖特征及冷熱溫度負荷變化規(guī)律。周嫻等[9]運用紅外熱像技術研究中醫(yī)五臟寒熱證素特征與紅外熱像圖之間的關系。李洪娟等[10]則詳細論述中醫(yī)證候理論與熱力學理論的內在關聯(lián)性，闡述采用熱力學方法研究中醫(yī)證候的基本原則、方法、技術、手段，以及熱力學方法研究中醫(yī)證候的特點和優(yōu)勢等，提出證候熱力學研究概念。

在動物實驗方面也有部分紅外熱像技術運用的報道，袁永明等[11]對寒證熱證大鼠模型的紅外熱圖進行了研究。馬小鑫[12]通過紅外熱像技術在大鼠上的實踐建立了中藥寒熱藥性的研究方法。孫麗斌等[13]對紅外熱圖與腫瘤中醫(yī)證候相關性作了研究。提示紅外熱像技術是研究中醫(yī)證候屬性的一種有益技術手段。

3.3 本研究采用紅外熱像技術對糖皮質激素藥源性虛證小鼠體表溫度的分析

本課題前期做過多次探索，短期(4 d內)使用糖皮質激素藥物體重顯著下降陰虛見證顯著。長期(7 d以上)使用糖皮質激素藥物體重下降減緩，體表溫度下降等。兩周為糖皮質激素影響的主要變化周期，兩周后趨于穩(wěn)定變化不大。實驗中三個藥物極低劑量即為臨床藥物參考用量按體重折算到小鼠所得，高劑量參考文獻該藥物造模常用量。低、中劑量則選取極低劑量和高劑量之間地合適劑量。

本研究運用紅外熱像技術檢測了三種糖皮質激素造模后小鼠的體表溫度變化?？紤]到所采集圖像信息能盡可能全面反映小鼠的體表溫度差異，我們選擇了拍攝小鼠自然站立狀態(tài)下側腹部整體輪廓圖像，包括小鼠頭面部、頸項部、側腹部、全尾等區(qū)域溫度，且背部與腹部的切緣溫度可以有效顯示。其中，小鼠頭部的眼睛區(qū)域溫度最高、尾部溫度通常最低、而側腹部溫度從頭到尾逐步降低。根據(jù)以上現(xiàn)象，我們選取了頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾根部最低溫度三個指標進行分析。

結果表明，給予氫化可的松和地塞米松后小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度均出現(xiàn)下降，而潑尼松龍對小鼠體表溫度影響不明顯。另外三批實驗中我們也同步檢測了小鼠的腋溫、曠場活動度、體重等，腋溫變化不顯著，(故未給出具體數(shù)據(jù))，曠場活動度有一定程度的下降，體重在給藥后下降7 d后下降減緩。另外由于糖皮質激素藥理作用復雜，直接作用機體可能造成類似陰虛陽亢征兆，長期使用造成機體出現(xiàn)陽虛見證，具有直接和間接雙重影響。中、高劑量下小鼠體表溫度略有升高可能是由于氫化可的松直接作用機體造成，但是用藥14 d后氫化可的松各劑量組體表溫度均顯著低于正常對照組是明確的。

基于本研究大量的實驗數(shù)據(jù)，我們認為小鼠頭部最高溫度、軀干平均溫度和尾部最低溫度三個指標可以反映出小鼠整體體表溫度的變化，且這三個溫度指標的變化具有一致性。其中，頭部最高溫度能更好反映小鼠是否有陽亢見證(是否頭部溫度過高)，中醫(yī)認為頭為諸陽之會，所有的陽經都匯集到頭部，小鼠頭部體表溫度最高符合中醫(yī)理論；而尾根部最低溫度反映小鼠的陽虛見證(是否尾根部溫度過低)；軀干平均溫度則更加反映小鼠整體上的體表溫度變化。此外，小鼠的體表最高與最低體溫的溫差、或頭部溫度高于平均溫度的比值等相關轉化指標也有助于深刻揭示溫度變化的靈敏性，有待于深入探索。

由此得出結論(1)紅外熱像技術可以評估實驗小鼠 “陽”盛衰程度。(2)氫化可的松和地塞米松可誘發(fā)藥源性虛證小鼠類似陽虛的外寒征象，且隨著用藥時間和劑量的增加而小鼠陽虛外寒征象越顯著。