柯 波 俞菊紅 涂俐嫣 程洪波

1.江西省人民醫(yī)院血液內(nèi)科，江西南昌 330006；2.江西省人民醫(yī)院醫(yī)學影像科，江西南昌 330006

高三尖杉酯堿（HHT）是從我國特有植物海南粗榧中提取出一種生物堿，其具有明顯的抗腫瘤作用，主要用于慢性粒細胞白血?。–ML）和急性髓系白血病（AML）的治療［1-3］。2010 年HHT 被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準用于難治/復發(fā)性CML 的治療［4］。HHT的抗白血病作用機制復雜，主要表現(xiàn)為抑制蛋白合成，特別是抗凋亡和細胞增殖相關蛋白，例如X 連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）、髓細胞白血病因子1（Mcl）和Myc原癌基因（cMyc）等［5-6］。HHT 發(fā)揮其生物學功能的一個潛在機制是通過其與核糖體A 位點的結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)的合成［7］，還可以與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，通過抑制TET 蛋白1（TET1）和FMS 樣酪氨酸激酶3（FLT3）的表達影響白血病細胞的增殖［8-9］。然而，目前尚不清楚HHT 是否有其他抗白血病作用的潛在機制。本研究通過HHT 作用于人白血病K562 細胞，分析其對細胞增殖和DNA 損傷相關蛋白表達的影響，探究其可能作用的信號通路機制，為CML 臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料

人白血病K562 細胞由實驗室保存。HHT 為杭州民生藥業(yè)公司產(chǎn)品（17021819）；胎牛血清（11011-8611）、RPMI-1640 培養(yǎng)基（31800-500）和PBS 磷酸緩沖液（P1031）購于北京索萊寶公司；細胞培養(yǎng)板和細胞培養(yǎng)瓶購于無錫NEST 公司；兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，ab181602）、兔抗人細胞周期蛋白D1（CyclinD1，ab134175）、兔抗人核蛋白MKI67（Ki-67，ab16667）、兔抗人組蛋白H2AX 的磷酸化（γ-H2AX，ab81299）、磷酸化兔抗人毛細血管擴張性共濟失調(diào)癥突變蛋白激酶（p-ATM，ab81292）單克隆抗體均購于美國Abcam 公司；羊抗兔標記辣根過氧化物酶（HRP）二抗購于北京索萊寶公司（SE134）。BeyoECL Star 化學發(fā)光試劑盒（P0018AS）購于上海碧云天生物技術有限公司；倒置光學顯微鏡購于江南公司（XD-202）；CO2細胞恒溫培養(yǎng)箱購于日本三洋公司（MCO175）；酶標儀購于深圳雷杜公司（RT6100）；電泳儀（PowerPac HC）和轉(zhuǎn)膜儀（Trans-blot SD）購于美國Bio-Rad 公司；化學發(fā)光成像系統(tǒng)購于上海勤翔科學儀器公司（ChemiScope6000）。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組

人白血病K562 細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)液中，37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細胞長至對數(shù)生長期時用于本研究。將其分為HHT 組和對照組，HHT 組又分為5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L 不同濃度的HHT 亞組。

1.3 CCK-8 細胞增殖檢測

選取對數(shù)生長期的K562 細胞，按5×105個/mL 的細胞密度接種于96 孔板中，HHT 組分別加入不同濃度的HHT（5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L），培養(yǎng)48 h 后，每孔中加入10 μL CCK-8試劑，培養(yǎng)1 h 后用酶標儀檢測450 nm 處的OD 值，每組設置6 個復孔。細胞增殖抑制率=（1-實驗組OD 值均值/對照組OD值均值）×100%。

1.4 Western blot 檢測細胞中Cyclin D1、Ki-67、γ-H2AX 和p-ATM 蛋白表達水平

取對數(shù)生長期的K562 細胞，按5×105個/mL 的細胞密度接種于6 孔板中，HHT 組分別加入不同濃度的HHT（5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L），常規(guī)培養(yǎng)48 h 后收集細胞，加入裂解液（含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑） 提取細胞全蛋白，BCA 法測定蛋白濃度。取20 μg 的蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，于5%的脫脂奶粉中室溫封閉2 h；4℃條件下一抗孵育過夜，次日將膜用含吐溫磷酸緩沖液（PBST）漂洗4 次，10 min/次；用HPR二抗室溫振蕩孵育2 h；PBST 漂洗4 次，10 min/次；配置化學發(fā)光反應液并孵育PVDF 膜，于化學發(fā)光成像系統(tǒng)中拍照，用軟件分析目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶光密度比值，得出目的蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0 軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間的差異比較采用LSD-t檢驗。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HHT 抑制K562 細胞增殖

CCK-8 方法檢測結(jié)果顯示，HHT 處理細胞48 h 后可對K562 細胞增殖產(chǎn)生明顯的抑制作用。不同濃度（5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L）的HHT 對K562細胞增殖抑制率分別為（4.70±0.45）%、（9.80±0.35）%、（34.00±0.29）%和（41.00±0.64）%；隨著HHT 濃度增加抑制效應逐漸增強。

2.2 HHT 對細胞增殖相關蛋白表達的影響

與對照組比較，5×10-9、1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L HHT 組均可下調(diào)Cyclin D1 蛋白，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。與對照組比較，5×10-8、1×10-7mol/L HHT 組Ki-67 蛋白表達水平明顯下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見圖1。

2.3 HHT 對DNA 損傷相關蛋白表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，5×10-8、1×10-7mol/L HHT 組可誘導γ-H2AX 蛋白表達上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。與對照組比較，1×10-8、5×10-8、1×10-7mol/L HHT 組可上調(diào)p-ATM 水平，差異均有統(tǒng)計學意義（均P ＜0.05）。見圖2。

3 討論

AML 是一種惡性血液腫瘤，化療為其主要治療手段之一。HHT 在我國較早用于白血病的治療，其與柔紅霉素、阿霉素和阿糖胞苷聯(lián)合用于一線治療［10-11］?；贖HT 的化療策略，在治療AML 患者初期方面表現(xiàn)出良好的效果，HHT 單獨治療可有效抑制AML 細胞的體外生長和存活，并可限制AML 患者的疾病進展，這種抑制作用主要歸因于HHT 誘導的細胞周期阻滯和抑制細胞增殖，以及增強髓系細胞的分化［12］。

圖1 不同濃度HHT 對K562 細胞中增殖相關蛋白表達的影響

圖2 不同濃度的HHT 對K562 細胞中DNA 損傷相關蛋白表達的影響

HHT 可以通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路抑制抗凋亡蛋白Bcl-6 的表達，誘導K562 細胞凋亡［13］，HHT 還可以誘導耐藥的K562細胞發(fā)生自噬以及BCR-ABL 融合蛋白的泛素化降解［14］。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度HHT 均可抑制K562 細胞的增殖，HHT 還可以通過降低線粒體膜電位誘導細胞凋亡［15］。Western blot 實驗結(jié)果顯示在5×10-8mol/L和1×10-7mol/L 濃度HHT 處理的K562 細胞中，細胞增殖相關核抗原Ki-67 的表達水平明顯下調(diào)，不同濃度的HHT 處理還可下調(diào)Cyclin D1 的表達水平，Cyclin D1 主要參與G1/S 細胞周期進程的調(diào)控，在多數(shù)腫瘤細胞中出現(xiàn)上調(diào)表達［16］。研究結(jié)果提示HHT 抑制K562 細胞增殖可能與Ki-67 和CyclinD1 的下調(diào)表達有關。

在白血病的臨床治療中，蒽環(huán)類藥物和拓撲異構(gòu)酶抑制劑藥物均可誘導細胞DNA 損傷和細胞凋亡。然而，HHT 是否具有誘導DNA 損傷作用尚未報道，本研究通過Western blot 分析，HHT 處理的K562 細胞中磷酸化組蛋白γ-H2AX 的表達上調(diào)，γ-H2AX 是一種DNA 損傷標志物，主要參與DNA 損傷應答過程［17-18］。ATM 作為DNA 損傷的 “感應器” 監(jiān)視細胞DNA 損傷，ATM 發(fā)生自磷酸化激活并作為激酶磷酸化其底物細胞周期檢測點激酶2（Chk2），啟動DNA 損傷應答進程［19-20］。因此，本研究還分析了ATM 的磷酸化水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HHT 處理的K562 細胞中ATM 磷酸化水平明顯上調(diào)，提示HHT 處理的K562 細胞出現(xiàn)DNA 損傷，并激活DNA 損傷應答過程。

盡管治療所誘導的DNA 損傷廣泛存在，但是白血病細胞利用其DNA 損傷修復機制促使CML 的急變期轉(zhuǎn)化，并誘導細胞耐藥［21-22］。有研究發(fā)現(xiàn)HHT 聯(lián)合增強慢性粒細胞白血病對伊馬替尼的敏感性［23］，HHT 可以誘導SMAD 家庭成員3（smad3）蛋白的磷酸化并激活轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號途徑，導致白血病細胞G1期阻滯和細胞凋亡［24］。HHT 還可以通過抑制信號傳導與活化轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）和核因子-кB（NF-κB）等多種信號途徑，協(xié)同化療藥物增強敏感性［25-26］。綜上所述，HHT 對白血病K562 細胞的增殖具有抑制作用，并且可以誘導DNA 損傷，可能是HHT發(fā)揮其抗白血病作用的機制之一。