宋凈洋 車祥源 邢紅霞

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南衛(wèi)輝 453100；2.新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南新鄉(xiāng) 453000

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是中老年人群中常見的神經(jīng)退行性疾?。?］，以中腦黑質(zhì)多巴胺（dopamine，DA）能神經(jīng)元退行性變性死亡以及路易小體的形成為主要病理生理特征。PD 的發(fā)病機制目前尚未闡明，可能與環(huán)境、遺傳、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激、免疫異常、細胞凋亡等諸多因素有關(guān)。目前PD的治療主要以改善癥狀的藥物治療為主，但仍然缺乏有效的根治措施，到了疾病晚期階段，患者往往生活難以自理，因此給PD 患者其所在的家庭及社會都帶來沉重的負擔。要進行PD 疾病的研究，通常需要構(gòu)建理想的PD 動物模型。嚙齒類動物與人的差異較大，而非人靈長類（non-human primates，NHPs）的行為能力和神經(jīng)解剖學復雜性非常類似于人類，因此NHPs的使用無疑是研究PD 的關(guān)鍵工具。因此筆者主要針對PD 的NHPs 動物模型做一介紹。

1 現(xiàn)有PD 動物模型

PD 的研究過程中有兩個主要困難：一是缺乏完整的參與神經(jīng)退行性過程的分子機制，二是缺乏擁有充分的可進行方法評估的預測模型。第一個困難可以通過在眾多類型PD 動物模型中研究得出。而第二個困難目前尚未解決。目前通過基因改造和神經(jīng)毒素的干預產(chǎn)生的PD 動物模型并沒有產(chǎn)生在行為和病理結(jié)果上均可預測的PD 動物模型。

最近，通過將外源基因引入NHPs 基因組或改變NHPs 的內(nèi)源基因，產(chǎn)生了幾種NHPs 轉(zhuǎn)基因動物模型［2］。雖然NHPs 轉(zhuǎn)基因動物模型有助于了解PD 的發(fā)病機制，但是由于NHPs 與嚙齒類動物比較壽命長，因此對NHPs 的PD 模型發(fā)病機制的研究需要很長的時間。而當前可用的遺傳模型也不能完全誘導出具有明顯神經(jīng)退行性變的PD 表型［3］，神經(jīng)毒性模型則可以通過破壞黑質(zhì)紋狀體通路誘導出具有明顯神經(jīng)退行性變的PD 表型［4］。NHPs 動物模型是一種公認的PD 模型，現(xiàn)在研究大多通過使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶（MPTP）和6-羥基多巴胺（6-OHDA）誘導黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元選擇性變性誘導PD 模型［5］，這些模型可以通過神經(jīng)毒素的全身或局部給藥來發(fā)揮作用［6］。

2 NHPs 中經(jīng)典PD 動物模型

2.1 NHPs 中MPTP 誘導PD 動物模型

MPTP 是高度親脂性化合物，它可以快速穿過血腦屏障。MPTP 毒性的潛在機制是單胺氧化酶B 將MPTP 轉(zhuǎn)化為陽離子MPP+，該陽離子可通過黑質(zhì)致密部進入DA 能神經(jīng)元。MPP+主要通過阻斷線粒體復合體Ⅰ的活性導致ATP 消耗和氧化應(yīng)激增加［7］，從而誘導PD 模型。但采用MPTP 誘導的急性神經(jīng)毒性模型無法復制出與PD 路易小體相似的的蛋白質(zhì)聚集體，即使長期、大劑量的MPTP 誘導的靈長類PD 動物模型也無法復制出α-突觸核蛋白聚集的病理現(xiàn)象［8-9］。

與其他可用的PD 模型比較，MPTP 模型不需要熟練的立體定位技術(shù)，其在生化、解剖學和行為學方面與人類PD 癥狀具有較大的相似性。但與6-OHDA模型比較，在首次注射MPTP 后的24 h 內(nèi)MPTP 模型可出現(xiàn)因為心臟毒性而引起的劑量依賴性死亡［10］。此外，盡管MPTP 本身并不直接有害，但其代謝產(chǎn)物MPP+具有劇毒，所以采用MPTP 處理動物模型時對處理動物的人員有嚴重的安全隱患［11］，所以需要具有嚴格安全設(shè)備的實驗室。

2.2 NHPs 中6-OHDA 誘導PD 動物模型

6-OHDA 是一種兒茶酚胺能神經(jīng)毒素，廣泛用于誘導嚙齒動物和NHPs 動物中DA 能神經(jīng)元的死亡［12］。6-OHDA 不能透過血腦屏障，所以需要將6-OHDA立體定位直接注入到目標大腦區(qū)域。兒茶酚胺能神經(jīng)元可以通過單胺轉(zhuǎn)運蛋白選擇性吸收6-OHDA，通過增加活性氧的產(chǎn)生誘導交感神經(jīng)元的丟失，破壞能量代謝和神經(jīng)元的活動從而誘導PD 模型［13］。

在NHPs 動物中，將6-OHDA 注入到黑質(zhì)紋狀體束或紋狀體內(nèi)會導致典型的帕金森樣運動缺陷，這與黑質(zhì)區(qū)酪氨酸羥化酶（TH）陽性細胞的丟失有關(guān)。除了將6-OHDA 立體定位直接注入到目標大腦區(qū)域外，也可以全身給藥以模擬心臟自主神經(jīng)功能失調(diào)狀態(tài)［14］。靜脈注射6-OHDA 會引起心臟兒茶酚胺能神經(jīng)支配的喪失和循環(huán)兒茶酚胺水平的降低［15］，但在6-OHDA 模型中仍然沒有觀察到路易小體或α-突觸核蛋白的聚集體。

3 NHPs 中新型PD 動物模型

經(jīng)典的PD 動物模型（6-OHDA 和MPTP 模型）雖然能夠模擬人類PD 的病理生化改變，但不能模擬PD 主要的病理生理特征，即細胞內(nèi)路易小體的形成。而α-突觸核蛋白是形成路易小體的重要成分，其主要由清理毒性蛋白的泛素-蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitin proteasome system，UPS）降解［16］。因此McNaught 等［17］構(gòu)建出一種基于抑制UPS 的PD 模型：經(jīng)PSI 系統(tǒng)（可逆性合成小肽的蛋白酶抑制因子）處理的大鼠在飼養(yǎng)中出現(xiàn)以下癥狀：活動減少、僵直、姿勢異常、震顫等的帕金森綜合征表現(xiàn)，并出現(xiàn)了與PD 相同的神經(jīng)病理學特征：黑質(zhì)中TH 陽性DA 神經(jīng)元細胞的丟失，紋狀體DA 耗竭，α-突觸核蛋白和泛素在藍斑、迷走神經(jīng)背核等的聚集積累。PSI 誘導出的模型和現(xiàn)有使用UPS 抑制劑乳胞素［18］實驗結(jié)果相一致。許多研究者使用UPS 抑制劑對嚙齒類動物和靈長類進行全身系統(tǒng)的注射［19］，卻沒有復制出PD 模型［20］，該系統(tǒng)模型構(gòu)建的失敗可能與一系列因素，如藥物劑量、吸收的因素、藥物暴露時間、通過血腦屏障的通道、所用溶劑等相關(guān)。然而，在黑質(zhì)紋狀體內(nèi)直接注射UPS 抑制劑產(chǎn)生的初步效果與Lillethorup 等［21］描述的相一致。注射乳胞素到魚的腦脊液中構(gòu)建的模型，也出現(xiàn)蛋白聚集體、DA 神經(jīng)元的丟失等病理特征［22］。研究者在嚙齒類動物中的研究顯示TH 陽性的神經(jīng)元細胞的丟失數(shù)量表現(xiàn)出乳胞素-劑量依賴性。這提示，利用腦內(nèi)UPS 抑制體系的作用可以構(gòu)建一個與之一致并可重復的模型［23］。

利用UPS 抑制劑建立的模型能夠完整地展現(xiàn)出：PD 的運動和非運動臨床特征，TH 陽性神經(jīng)元細胞的丟失，黑質(zhì)區(qū)炎癥標志物的增多，內(nèi)含α-突觸核蛋白和泛素的包涵體的聚集積累等病理特點。因此構(gòu)建出蛋白酶體功能障礙的NHPs 模型將對探究出PD的發(fā)病機制、疾病防治、臨床藥物有效性和安全性評價具有獨特的優(yōu)勢。

4 NHPs 中PD 動物模型評估

4.1 行為學觀察

為了更好地研究PD，需要建立可以高度復制的PD 動物模型，以解決包括大腦病理變化在內(nèi)的所有與PD 相關(guān)的問題。首先，可以使用臨床評分量表記錄典型的PD 癥狀（如正常、肌肉僵硬等）及異常的非自主運動癥狀（如面部及全身行為等）。這些臨床評分可以通過雙盲方式觀看動物的事后視頻記錄，記錄患病動物的自發(fā)運動能力來進行。

4.2 正電子發(fā)射斷層掃描（PET）

PET 成像是一種相對非侵入性的神經(jīng)成像技術(shù)，可用于闡明與PD 相關(guān)的功能改變，并通過評價黑質(zhì)紋狀體DA 系統(tǒng)的完整性來提供診斷信息［24-26］。在異氟醚麻醉下，NHPs 可進行PET 掃描，使用包括18FDOPA、18F-FP-CIT、11C-FP-CIT、11C-CFT、11C-PE2I、18F-AV-133、11C-DTBZ 等在內(nèi)的正電子發(fā)射同位素標記的示蹤化合物，可以對體內(nèi)的生化過程進行成像和測量［27-28］。

4.3 磁共振成像（MRI）

功能性和結(jié)構(gòu)性腦成像的快速發(fā)展使得觀察腦功能的特定變化成為可能。MRI 比PET 應(yīng)用廣泛得多，是在體內(nèi)對整個大腦進行解剖成像最常用的系統(tǒng)。它可以非侵入性獲取PD 引起病變的功能性圖像［29］。NHPs 是進行PD 研究的最合適的物種，目前已越來越多地通過MRI 進行研究。MR 光譜也可以用作非侵入性工具，通過測量某些代謝物的存在和濃度來評估與神經(jīng)變性和抗PD 治療相關(guān)的體內(nèi)動態(tài)變化［30］。

4.4 病理學檢測

雖然對黑質(zhì)紋狀體系統(tǒng)的評價是PD 研究的基本工具，但病理學檢測也很重要。我們建議在戊巴比妥深度麻醉下，行心內(nèi)灌注肝素化鹽水，然后取出大腦，固定后進行形態(tài)學處理。猴腦的大?。ㄅc大鼠或小鼠比較）具有以下優(yōu)點：新鮮器官可以切片，確定區(qū)域，并且可以采集特定目標區(qū)域的小組織樣本。也可以通過電化學檢測功能的高效液相色譜法（HPLC）檢測新鮮腦樣本、腦脊液或通過體內(nèi)微透析獲得細胞外液中的DA 和DA 代謝產(chǎn)物3，4-二羥苯酰乙酸（DOPAC）和高香草酸（HVA）的量［31］。此外，還可以通過免疫組織化學方法來測定黑質(zhì)DA 能神經(jīng)元的數(shù)目。

5 結(jié)論

盡管動物模型可能無法充分反映人類疾病的特征，但它們可用于分析疾病的某些方面，而使用簡單的體外模型無法對其進行全面研究。人們對NHPs 動物模型的興趣逐漸增加，因為它們是唯一在臨床試驗前進行臨床前評估時與人類具有高度相似性的相關(guān)物種。所以，在臨床前階段，將NHPs 用作實驗模型具有許多顯著的優(yōu)勢。本文通過對PD 的NHPs 動物模型的介紹，可以幫助研究人員根據(jù)研究的特定目的選擇合適的造模方法。在PD 的NHPs 動物模型中進行的研究可能有助于開發(fā)用于早期診斷的工具，還有可能幫助開發(fā)旨在阻止或減慢疾病進展的下一代PD藥物。