陳 沫，陳禮峰，周震宇，劉華明，顧炳仁

蘇州市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究中心，蘇州 215000

阿魏酸哌嗪是一類非肽類內(nèi)皮素受體拮抗劑，是當(dāng)歸、川穹等中藥的有效成分阿魏酸經(jīng)與哌嗪成鹽的化學(xué)合成藥物。作為我國(guó)自主研發(fā)的藥物，阿魏酸哌嗪片在臨床上主要用于各類伴有鏡下血尿和高凝狀態(tài)的腎小球疾病，如腎炎、慢性腎炎、腎病綜合癥、早期尿毒癥以及冠心病、腦梗塞及脈管炎等的輔助治療[1，2]。阿魏酸哌嗪片為醫(yī)保乙類藥品，也是《中國(guó)藥典》[3]收載品種，臨床應(yīng)用廣泛，療效明確。在目前發(fā)表的文獻(xiàn)中，未見(jiàn)對(duì)阿魏酸哌嗪片溶出度研究的文章。在多種不同pH 溶出介質(zhì)中溶出曲線測(cè)定不僅是口服固體制劑質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要方法，也為仿制藥一致性評(píng)價(jià)提供了依據(jù)[4]。

本研究建立了高效液相色譜法對(duì)阿魏酸哌嗪片進(jìn)行溶出曲線的測(cè)定，考察了4 家生產(chǎn)企業(yè)12批阿魏酸哌嗪片在4 種不同pH 溶出介質(zhì)中的溶出曲線，并采用f2因子進(jìn)行了體外溶出一致性評(píng)價(jià)，為該制劑內(nèi)在質(zhì)量的優(yōu)劣及生物等效性試驗(yàn)提供參考。

1 儀器與藥品、試劑

708-DS 全自動(dòng)藥物溶出儀 （美國(guó)安捷倫公司）；Waters e2695 高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）；ZKT-18F 真空脫氣機(jī) （天大天發(fā)科技有限公司）；XPE105 分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）。

阿魏酸哌嗪對(duì)照品 （中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100834-201302）；阿魏酸哌嗪片樣品（批號(hào)：181004、171104、180503，A 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號(hào)：180802、180101、190301，B 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號(hào)：171105、190207，C 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號(hào)：180708，C企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，180 片/瓶；批號(hào)：180901、181203，D 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，50 片/瓶；批號(hào)：180201，D 企業(yè)，規(guī)格：50 mg，素片，120 片/瓶）。

無(wú)水乙酸鈉、氫氧化鈉、磷酸二氫鉀、鹽酸、冰醋酸均為分析純；水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：1%冰醋酸-甲醇（60∶40）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

2.2 溶出條件

根據(jù)《中國(guó)藥典》和《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]中溶出度試驗(yàn)方法，分別以pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和水作為溶出介質(zhì)。介質(zhì)體積900 mL，溶出方法：籃法，轉(zhuǎn)速：50 r·min-1；取樣時(shí)間：5、10、15、30、45、60 min。采用槳法50 轉(zhuǎn)時(shí)，各樣品片掉落溶出杯中不同位置，樣品片周圍溶出介質(zhì)流速可能不同，導(dǎo)致5 min 時(shí)RSD 偏大。

2.3 溶液的制備

2.3.1 對(duì)照品溶液 精密稱取阿魏酸哌嗪對(duì)照品55 mg，置100 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)溶解并稀釋至刻度，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液5 mL，置50 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 供試品溶液 取每批樣品12 片，分別在pH 1.2 鹽酸溶液、pH 4.0 醋酸鹽緩沖液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液和水4 種介質(zhì)條件下進(jìn)行試驗(yàn)，在各時(shí)間點(diǎn)取溶液用0.45 μm 濾膜濾過(guò)，即得。

2.3.3 陰性對(duì)照溶液 選取A 企業(yè)樣品進(jìn)行研究，按企業(yè)處方比例配制空白輔料約1 片量，分別加4種溶出介質(zhì)900 mL，超聲溶解，濾過(guò)，即得。

2.4 溶出方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 專屬性試驗(yàn) 分別取陰性對(duì)照溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1。陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加相應(yīng)溶出介質(zhì)稀釋成濃度為0.2200、1.100、5.500、11.00、22.00、55.00、110.0、220.0 μg·mL-1的溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品濃度（X）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程及線性范圍見(jiàn)表1。

2.4.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下各溶出介質(zhì)制備的阿魏酸哌嗪對(duì)照品溶液（55 μg·mL-1）進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果RSD 分別為0.38%、0.28%、0.25%、0.08%，表明儀器的精密度良好。

表1 回歸方程與線性范圍

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取4 種溶出介質(zhì)中60 min 時(shí)的供試品溶液（55 μg·mL-1）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣，記錄各峰面積，結(jié)果阿魏酸哌嗪峰面積RSD 均小于1.0%，表明供試品溶液在4種溶出介質(zhì)中室溫放置12 h 穩(wěn)定性良好。

2.4.5 回收率試驗(yàn) 按處方比例，分別精密稱取相當(dāng)于樣品標(biāo)示量50%、75%、100%的阿魏酸哌嗪對(duì)照品，稱取相應(yīng)量的A 企業(yè)空白輔料，分別按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行溶出試驗(yàn)，經(jīng)60 min 時(shí)，取續(xù)濾液進(jìn)樣，并按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖峰面積，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示RSD%小于2.0%，方法回收率良好。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.4.6 濾膜吸附性試驗(yàn) 取4 種溶出介質(zhì)中60min 時(shí)的供試品溶液，分別經(jīng)離心和濾膜過(guò)濾2、4、8 mL 后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果離心后阿魏酸哌嗪峰面積與過(guò)濾后峰面積基本一致；濾膜對(duì)阿魏酸哌嗪基本無(wú)吸附。

2.4.7 管路吸附性 取4 種溶出介質(zhì)中60 min 時(shí)的供試品溶液,經(jīng)手動(dòng)取樣和儀器自動(dòng)取樣并進(jìn)行測(cè)定，兩種取樣結(jié)果測(cè)得阿魏酸哌嗪峰面積基本一致，表明儀器管路對(duì)阿魏酸哌嗪基本無(wú)吸附。

2.5 阿魏酸哌嗪pH-溶解性曲線

按照《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》[5]配制pH 值分別為1.0、1.2、2.0、4.0、5.5、6.0、6.8、7.0、8.0 的溶出介質(zhì)。取阿魏酸哌嗪對(duì)照品約50 mg，分別加入以上溶出介質(zhì)各2 mL，超聲處理30 min，置搖床中振蕩1 h，經(jīng)0.45 μm 濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液，用HPLC 法測(cè)定溶液中阿魏酸哌嗪的濃度，計(jì)算不同pH 下阿魏酸哌嗪的溶解度，并繪制阿魏酸哌嗪的pH-溶解性曲線，見(jiàn)圖2。

2.6 溶出曲線制備

A、B、C、D 企業(yè)生產(chǎn)的4 批阿魏酸哌嗪片（181004、180802、171105、180901） 在4 種不同pH介質(zhì)中的溶出行為（n=12）見(jiàn)圖3。

同一企業(yè)生產(chǎn)的不同批號(hào)的阿魏酸哌嗪片在4種不同pH 介質(zhì)中的溶出曲線（n=12）見(jiàn)圖4。

2.7 相似性評(píng)價(jià)

參照《普通口服固體制劑溶出度試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，應(yīng)用相似因子f2的模型非依賴方法，來(lái)比較溶出曲線相似性。非模型依賴的f2計(jì)算公式為：

其中Rt、Tt分別為各時(shí)間點(diǎn)參比制劑和供試制劑的溶出度。由于阿魏酸哌嗪片為中國(guó)自主研發(fā)的藥物，國(guó)外并無(wú)同類型產(chǎn)品，故本試驗(yàn)采用最早生產(chǎn)阿魏酸哌嗪片A 企業(yè)的一個(gè)批次作為參比制劑，即批號(hào)181004。如果50≤f2≤100，可認(rèn)為溶出曲線相似，普通固體制劑若15 min 內(nèi)的平均溶出量大于85%時(shí)，可認(rèn)為溶出曲線相似，不再計(jì)算f2值，溶出曲線f2值測(cè)定結(jié)果匯總見(jiàn)表3。

2.7.1 pH 1.2 鹽酸溶液 12 批次樣品在60 min 時(shí)累計(jì)溶出量均低于15%，試驗(yàn)過(guò)程中樣品均出現(xiàn)溶脹、未完全崩解現(xiàn)象，不進(jìn)行f2因子計(jì)算。

2.7.2 pH 4.0 醋酸鹽緩沖液 A 企業(yè)的3 批樣品和B 企業(yè)的2 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量均≥85%，其余7 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量均<85%，且f2值均<50。由圖4 可見(jiàn)，各樣品在溶出介質(zhì)pH 4.0 醋酸鹽緩沖液中溶出行為差異較大。

2.7.3 水和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液 3 家企業(yè)的9 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量均≥85%，可認(rèn)為A、B、D企業(yè)的阿魏酸哌嗪片溶出行為相似。C 企業(yè)的3 批樣品在15 min 內(nèi)溶出量<85%，且C 的3 批次f2值分別為24.0、24.2、25.6，均<50，表明C 企業(yè)與A 企業(yè)樣品溶出行為差異較大。

表3 f2 因子結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

3 討論

早期的藥品研發(fā)過(guò)程不能滿足現(xiàn)行一致性評(píng)價(jià)要求，作為原研制劑的關(guān)鍵技術(shù)屬性尚不清楚，因此對(duì)于此類制劑，進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)量屬性的考察，建立并驗(yàn)證有適度區(qū)分力的溶出曲線方法，考察產(chǎn)品批內(nèi)、批間溶出曲線差異，對(duì)其一致性評(píng)價(jià)具有非常重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值。

所建立的HPLC 法測(cè)定阿魏酸哌嗪片溶出度曲線，并對(duì)該方法進(jìn)行了驗(yàn)證，與《中國(guó)藥典》紫外-可見(jiàn)分光光度法相比，本方法靈敏度高，專屬性好，準(zhǔn)確度高，可用于阿魏酸哌嗪片的含量測(cè)定，有利于對(duì)制劑質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制。

國(guó)外藥典并未收載阿魏酸哌嗪片同類型產(chǎn)品，本研究所選擇的參比制劑不是真正意義上的參比制劑，使用f2因子法只是為了評(píng)價(jià)不同企業(yè)生產(chǎn)的不同批次的阿魏酸哌嗪片是否存在差異。從溶出曲線結(jié)果看出，在pH 1.2 鹽酸的溶出介質(zhì)中所有生產(chǎn)企業(yè)各批次樣品溶出速率均較慢，在60 min 時(shí)累計(jì)溶出量均低于15%，樣品均出現(xiàn)溶脹、未完全崩解的現(xiàn)象，參考阿魏酸哌嗪的pH-溶出曲線，在pH 1.2鹽酸中溶解度為0.63 mg·mL-1，滿足漏槽條件，且阿魏酸哌嗪片為素片，提示該片存在胃中崩解釋放緩慢問(wèn)題，可能影響藥物吸收和藥效發(fā)揮。在水和pH 6.8 磷酸鹽緩沖液中各生產(chǎn)企業(yè)各批次產(chǎn)品都無(wú)較明顯區(qū)分力。在pH 4.0 醋酸鹽溶出介質(zhì)中除了A 企業(yè)3 批樣品溶出曲線相似，對(duì)其他3 家企業(yè)9 批樣品均有較明顯的區(qū)分力，提示不同企業(yè)生產(chǎn)處方工藝方面存在一定差異，企業(yè)應(yīng)加強(qiáng)處方工藝的篩選優(yōu)化，改進(jìn)提高生產(chǎn)工藝。