李天萍，于 勇，應(yīng)玉雯，楊雨晴，謝利軍，陳 娟，張宏文，周 辰，孫魯寧*，王永慶*

1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床藥理研究室，南京 210029；2 湖南食品藥品職業(yè)學(xué)院 藥學(xué)院，長沙 410208

伏立康唑為新一代的三唑類抗真菌藥物，其常用于預(yù)防和治療一些與侵襲性真菌感染相關(guān)的疾病[1，2]。然而，由于存在個體差異和治療窗較窄，伏立康唑可能導(dǎo)致一些不良反應(yīng)，如視覺障礙、光敏性、神經(jīng)毒性和肝功能障礙等[3]。伏立康唑及其代謝產(chǎn)物伏立康唑-N-氮氧化物血藥濃度與患者的臨床療效及不良反應(yīng)密切相關(guān)，監(jiān)測兩者血藥濃度可提高抗真菌治療的有效性和安全性[4]。伏立康唑-N-氮氧化物是伏立康唑通過細胞色素P450（CYP）酶代謝的主要產(chǎn)物，占其代謝物的70%以上。盡管伏立康唑-N-氮氧化物的藥物活性低于伏立康唑，但可以抑制與伏立康唑代謝相關(guān)的CYP450 酶的代謝活性[5]。因此，建立同時測定伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度的方法具有重要意義；可用于血藥濃度監(jiān)測或藥動學(xué)研究，以確定和調(diào)整給藥方案。

已有文獻報道，采用高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）和免疫分析法測定生物樣本中伏立康唑及其代謝物伏立康唑-N-氮氧化物的含量，但定量下限較高，最低僅為0.4 μg·mL-1，最高血藥濃度為1.6μg·mL-1，根據(jù)《化學(xué)藥物臨床藥代動力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，定量下限大于最高血藥濃度的1/20，不能滿足藥代動力學(xué)研究要求[6]。本研究旨在簡化分析步驟，基于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立一種更靈敏、簡便、可靠的人血漿中兩者同時定量分析的方法，并將該方法應(yīng)用于伏立康唑藥物代謝動力學(xué)研究。

1 材 料

1.1 藥品和試劑

伏立康唑?qū)φ掌罚ㄅ?00862-201402，純度99.7%，由中國食品藥品檢定研究院提供）；伏立康唑-N-氧化物對照品 （純度99.9%，批號2352-043A11，由TLC Pharmaceutical Standards 提供）；同位素內(nèi)標（伏立康唑-D3、伏立康唑-N-氮氧化物-D3同位素純度分別為98.8%、98.7%，由Toronto Research Chemicals 公司提供）；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純；氨水為分析純；試驗用水為純化水。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫1290 Infinity 高效液相色譜儀（G1316C柱溫箱，G4226A 多孔板自動進樣器，G4220A 二元高壓泵）；API 4000（美國應(yīng)用生物公司）；Analyst?軟件（1.6.3 版本）；BP 211D 電子天平（Sartorius 公司）等。

2 方 法

2.1 檢測條件

色譜條件：色譜柱：安捷倫ZORBAX SB-Aq（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；柱溫：38 ℃；流動相：含0.1%的甲酸（A）和甲醇（B）（梯度洗脫：0～3 min，45%B；3～3.1 min，45%～95%B；3.1～4.5 min，95%B，4.5～4.6 min，95%～45%B；4.6～6.0 min，45%B）；流速：0.6 mL·min-1；自動進樣器溫度：8 ℃；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：多重反應(yīng)監(jiān)測（MRM），離子化方式：電噴霧離子化（ESI）；離子極性：正離子；離子化電壓：5500 V；離子源溫度：500 ℃；霧化氣壓力：344.7 kPa；渦輪氣壓力：413.7 kPa；氣簾氣壓力：275.8 kPa；碰撞氣壓力：41.4 kPa。待測物伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物的二級質(zhì)譜圖見圖1。伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物及其內(nèi)標的化合物參數(shù)見表1。

表1 伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物及其內(nèi)標的化合物參數(shù)

2.2 儲備液與工作溶液的配制

分別精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?、伏立康?N-氮氧化物對照品適量，用乙腈溶解配制成濃度分別為1.00 mg·mL-1和400 μg·mL-1的儲備液。

分別精密量取伏立康唑儲備液和伏立康唑-N-氮氧化物儲備液適量，置于同一量瓶中，用0.1%氨水乙腈稀釋成濃度均為160 μg·mL-1的混合工作液。再用0.1%氨水乙腈逐級稀釋配制系列濃度的標準曲線用和質(zhì)控用混合工作液。

內(nèi)標儲備液及工作溶液：分別精密稱取伏立康唑-D3對照品、伏立康唑-N-氮氧化物-D3對照品適量，用乙腈溶解，分別配制成濃度均為125 μg·mL-1的儲備液。分別精密量取伏立康唑-D3儲備液和伏立康唑-N-氮氧化物-D3儲備液適量，置于同一量瓶中，用乙腈稀釋成30 ng·mL-1的混合內(nèi)標工作液。

2.3 標準曲線用與質(zhì)控用樣本的配制

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，加入50 μL 空白血漿，再分別加入2.5 μL 相應(yīng)濃度的標準曲線用或質(zhì)控用混合工作液，渦旋10 s，混勻，配制成含伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度分別為10.0、20.0、50.0、200、500、2000、3600、4000、7000、8000 ng·mL-1的標準曲線用及濃度分別為10.0、25.0、400、3000、6000 ng·mL-1的質(zhì)控用標準含藥血漿樣本。

2.4 血漿樣品的預(yù)處理

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，加入50 μL 血漿樣本，渦旋10 s，混勻，再加入200 μL 內(nèi)標工作溶液（30 ng·mL-1），渦旋1 min，用多管渦旋振蕩器渦旋5 min，于4 ℃、16000 r·min-1離心10 min。取上清液40 μL 加120 μL 純化水至自動進樣器樣品瓶中，渦旋混勻后，進行LC-MS/MS 分析。

3 方法學(xué)確證及結(jié)果

3.1 特異性考察

精密量取伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物和內(nèi)標儲備液適量，用含0.1%氨水的乙腈溶液稀釋數(shù)倍后進行測定，伏立康唑及其同位素內(nèi)標保留時間為2.6 min，伏立康唑-N-氮氧化物及其同位素內(nèi)標保留時間為1.0 min。取6 種不同來源的空白血漿，除不加內(nèi)標外，按“2.4”項下處理，制備空白血漿樣本并進行測定。本方法具有較高的選擇性，內(nèi)源性雜質(zhì)不干擾測定。見圖2。

3.2 標準曲線與定量下限

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，按“2.3”項下方法操作，配制系列標準曲線用標準含藥血漿樣本，同時制備空白血漿樣本，進行LC-MS/MS 分析，并記錄色譜圖。分別計算伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物的峰面積As和內(nèi)標峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面積比值f 對血藥濃度C 作權(quán)重回歸計算，根據(jù)最小二乘法得出直線回歸方程并制備標準曲線（f=a×C+b），權(quán)重系數(shù)為1/C2，計算各樣本實測濃度及準確度。伏立康唑、伏立康唑-N-氮氧化物典型標準曲線分別為：f=8.36×10-3C+2.79×10-2，r=0.9973；f=9.31×10-3C+3.39×10-2，r=0.9972。結(jié)果表明，伏立康唑及其代謝物伏立康唑-N-氮氧化物濃度在10.0～8000 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限均為10.0 ng·mL-1。

3.3 精密度與準確度試驗

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，按“2.3”項下方法操作，配制系列質(zhì)控用標準含藥血漿樣本，每個濃度配制并處理5 份樣本，共做3 批，計算批內(nèi)、批間精密度和準確度。該方法精密度和準確度良好。見表2。

3.3 介質(zhì)效應(yīng)

分別取6 種不同來源的空白血漿和純化水各50 μL，除乙腈不含內(nèi)標外，按“2.4”項下方法操作，取上清液作為溶劑，配制伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度為25.0 ng·mL-1和6000 ng·mL-1的介質(zhì)效應(yīng)樣本溶液和對照樣本溶液若干份。分別取上述溶液50 μL 加入濃度為3.00 μg·mL-1的內(nèi)標溶液2 μL，渦旋1 min，混勻，再取上清液40 μL 加120 μL純化水至自動進樣器樣品瓶中，渦旋混勻后，進行LC-MS/MS 分析。記錄色譜圖，計算樣本溶液、對照樣本溶液各濃度伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物的峰面積As和內(nèi)標峰面積Ai的平均值，各濃度樣本溶液峰面積的平均值與對照樣本溶液峰面積的平均值之比，即為相應(yīng)成分的基質(zhì)效應(yīng)。該方法待測物質(zhì)的測定不受基質(zhì)干擾。見表2。

表2 伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物精密度、準確度、介質(zhì)效應(yīng)和提取回收率結(jié)果

3.4 提取回收率

本試驗考察了伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物25.0、400、6000 ng·mL-1等3 個質(zhì)控濃度水平的提取回收率。通過比較相應(yīng)濃度質(zhì)控用標準含藥血漿樣本溶液中待測物或內(nèi)標的響應(yīng)值與同一濃度介質(zhì)效應(yīng)樣本溶液中待測物或內(nèi)標的響應(yīng)值，來評價回收率。該方法提取回收率良好。見表2。

3.5 穩(wěn)定性試驗

考察了伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物25.0、400、6000 ng·mL-1等3 個質(zhì)控濃度水平的血漿樣品在室溫放置20 h、-40 ℃條件下3 個凍融循環(huán)、-40 ℃條件下放置90 d 及處理后待測樣品溶液自動進樣器（10 ℃）放置24 h 的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物在各處置條件下穩(wěn)定。

3.6 稀釋可靠性和殘留效應(yīng)

取1.5 mL 塑料離心管數(shù)支，按“2.3”項下方法配制含伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物濃度均為12000 ng·mL-1的標準含藥血漿樣本，用空白血漿稀釋2 倍后，按“2.4”項下方法處理，重復(fù)稀釋6 次，測得濃度與加入濃度的偏差均小于±15.0%，表明該方法具有良好的稀釋可靠性。將標準含藥血漿樣本（8000 ng·mL-1）與空白血漿樣本輪流進樣，共10 次，在待測物和內(nèi)標出峰位置無明顯干擾，表明該方法殘留效應(yīng)符合要求。

4 伏立康唑注射液藥代動力學(xué)預(yù)試驗

試驗方案經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準，2 名中國健康受試者（男女各1 人）給予4 mg·kg-1的注射用伏立康唑（Pharmacia &Upjohn Company，規(guī)格200 mg）。于試驗第1 天早上8時空腹給藥，用250 mL 的0.9%氯化鈉注射液稀釋，配制成所需的輸液濃度。血樣采集前，埋置肝素鈉抗凝留置針頭，于給藥前（-30～0 min）及靜脈滴注給藥開始后15 min （0.25 h）、30 min （0.5 h）、45 min（0.75 h）、1、1.25、1.5、2 h （靜滴結(jié)束）、2.25、2.5、3、3.5、4、6、8、12、24、48、72 h 采集靜脈血4 mL，置于含EDTA 抗凝管中。輕搖后于4 ℃下離心，然后用吸管將血漿轉(zhuǎn)移至預(yù)先標記好的凍存管中，每個血漿樣本分成3 份，每份600 μL 置于1.5 mL 離心管中。立即以垂直方式置于-20 ℃冰箱保存，12 h 內(nèi)轉(zhuǎn)移至-70 ℃±10 ℃冰箱保存?zhèn)錅y。采用WinNonlin（8.0）非房室模型計算伏立康唑在人體的藥代動力學(xué)參數(shù)。

伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物血藥濃度-時間曲線見圖3。2 例受試者單次靜滴注射伏立康唑后的平均藥代動力學(xué)參數(shù)：AUC0-t均值為10285 ng·h·mL-1，AUC0-∞均值為12761 ng·h·mL-1，Cmax均值為1767 ng·mL-1，Tmax均值為2.0 h，t1/2均值為9.86 h；伏立康唑-N-氮氧化物的平均藥代動力學(xué)參數(shù)：AUC0-t均值為24220 ng·h·mL-1，AUC0-∞均值為30850 ng·h·mL-1，Cmax均值為1631 ng·mL-1，Tmax均值為5.0 h，t1/2均值為10.6 h。預(yù)試驗結(jié)果顯示，伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物Cmax接近，后者AUC 更大，提示代謝物同樣值得關(guān)注。

5 討論

伏立康唑和伏立康唑-N-氮氧化物在有機溶劑中具有較高的溶解度，故可以考慮用乙腈或甲醇沉淀血漿蛋白來提取待測物。試驗發(fā)現(xiàn)，血漿樣品經(jīng)甲醇沉淀時在出峰位置處基線明顯抬高，而乙腈沉淀時基線波動較小，出峰位置處無明顯的干擾峰，故采用乙腈作為沉淀劑。結(jié)果表明，用乙腈1∶4 處理可使回收率達85%以上，上清液加3 倍純化水稀釋后進樣，未觀察到明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

伏立康唑在正離子條件下有較強且穩(wěn)定的質(zhì)譜響應(yīng)，故以正離子方式進行檢測。在水相中加入0.1%的甲酸可以增加離子化效率并提高靈敏度。最低定量下限為10.0 ng·mL-1，滿足生物樣品測定過程中最低定量下限低于1/10～1/20 Cmax的要求。利用梯度洗脫優(yōu)化色譜分離條件，最初將低甲醇比（45%）維持3 min 以達到基本分離，然后在0.1 min 內(nèi)增加到95%，以沖洗內(nèi)源性成分，因有機流動相含量高，也提高了分析物的電離效率[7]。

與高效液相色譜法相比，LC-MS/MS 具有特異性和靈敏度高的優(yōu)點。與以往報道的LC-MS/MS 法相比，本研究乙腈沉淀提取待測物，0.1%甲酸和甲醇為流動相，具有更低的定量下限，操作簡單、經(jīng)濟。建立的HPLC-MS/MS 法可運用于伏立康唑靜滴注射人體作藥代動力學(xué)預(yù)試驗研究。