姜育燊，孟 帥，姜 儻，姚 利，徐 陽(yáng)，普智飛

(1.杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，浙江 杭州 310030；2.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510080；3.迪安診斷技術(shù)集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310030)

唐氏綜合征(Down syndrome，DS)是最常見(jiàn)的染色體病之一，其發(fā)病率約為1/700～1/1 000。該疾病的主要發(fā)病原因?yàn)闇p數(shù)分裂過(guò)程中，21號(hào)染色體分離異常，進(jìn)而導(dǎo)致染色體數(shù)目異常。目前其發(fā)病的直接病因尚未明確，已知其與母親年齡有關(guān)，如母親生育年齡大于35歲可顯著增加孕育DS患兒的風(fēng)險(xiǎn)。但也有大量年輕母親仍可孕育DS患兒，提示影響DS風(fēng)險(xiǎn)的因素復(fù)雜多樣。

亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是催化葉酸代謝途徑的關(guān)鍵酶。葉酸作為一碳單位轉(zhuǎn)移酶系的輔酶，對(duì)嘌呤和胸腺嘧啶的合成，具有重要作用。其編碼基因MTHFR677C>T突變可影響葉酸代謝，與神經(jīng)管畸形等多種遺傳缺陷相關(guān)。國(guó)外已有文獻(xiàn)報(bào)道，MTHFR基因677C>T與子代21三體綜合征，即唐氏綜合征相關(guān)[1]。目前已有部分針對(duì)中國(guó)漢族人群的研究，但相對(duì)國(guó)外研究仍較少，研究結(jié)果尚存爭(zhēng)議。本文就針對(duì)中國(guó)漢族人群MTHFR基因C677T位點(diǎn)(rs1801133)多態(tài)性與子代21三體綜合征的相關(guān)研究進(jìn)行薈萃分析，評(píng)估中國(guó)漢族人群MTHFR基因C677T多態(tài)性與子代21三體綜合征的相關(guān)性。

1對(duì)象與方法

1.1文獻(xiàn)檢索

全面檢索Pubmed、Google Scholar、Elsevier、Springer、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普數(shù)據(jù)庫(kù)，收集關(guān)于中國(guó)漢族人群MTHFR基因C677T多態(tài)性與子代21三體綜合征的研究。中文檢索策略為：(唐氏綜合征OR21三體)AND (MTHFROR亞甲基四氫葉酸還原酶)；英文檢索策略為：(Down Syndrome OR 21 trisomy)AND MTHFR AND(China OR Chinese)。無(wú)發(fā)表年限限制。所有研究對(duì)象限中國(guó)漢族人群。文種限定為中文或英文。

1.2文獻(xiàn)篩選

文獻(xiàn)初篩步驟：①在文獻(xiàn)檢索的結(jié)果中，根據(jù)標(biāo)題和摘要，初步剔除明顯不合格的文獻(xiàn)；②下載全文，對(duì)文獻(xiàn)資料進(jìn)行詳細(xì)閱讀和分析，進(jìn)一步確定文獻(xiàn)是否合格；③在閱讀文獻(xiàn)的過(guò)程中，根據(jù)文獻(xiàn)的參考文獻(xiàn)補(bǔ)充符合標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)。

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①研究對(duì)象為中國(guó)漢族人群；②涉及母代MTHFR C677T位點(diǎn)多態(tài)性與子代唐氏綜合征風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性；③為病例對(duì)照研究；③報(bào)道語(yǔ)言為中文或英文。

文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：①未設(shè)計(jì)對(duì)照組的研究；②病例組對(duì)照組年齡不匹配的研究(年齡差>5歲)；③為家系研究；④研究對(duì)象為非漢族人群；⑤綜述文獻(xiàn)；⑥檢測(cè)對(duì)象為非母代基因多態(tài)性的文獻(xiàn)；⑦對(duì)唐氏綜合征無(wú)診斷結(jié)論，或無(wú)臨床結(jié)局的研究，如唐篩、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前DNA檢測(cè)(noninvasive prenatal testing，NIPT)等篩查結(jié)果作為分組標(biāo)準(zhǔn)；⑧對(duì)同一研究者/研究團(tuán)隊(duì)發(fā)表的不同文獻(xiàn)，只選取其中病例數(shù)量最高且質(zhì)量最高者，其余排除。

1.3文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

依照相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)納入的研究進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[2]：1)對(duì)照組設(shè)置是否匹配；2)病例組研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)及其構(gòu)成特征是否明確；3)是否符合Hardy-Weinberg平衡；4)基因分型擴(kuò)增步驟，是否包含有引物信息等明確的檢測(cè)方法描述；5)統(tǒng)計(jì)方法是否包含P值和OR值的計(jì)算。上述標(biāo)準(zhǔn)中每滿足一項(xiàng)得1分，總分≥3分者，質(zhì)量可靠。由兩名評(píng)估人員根據(jù)上述統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，分別進(jìn)行評(píng)估后，交叉核對(duì)。如遇分歧，討論并由第三位研究者協(xié)助解決。

1.4信息提取

各文獻(xiàn)信息提取內(nèi)容包括：作者、發(fā)表年份、地區(qū)、基因分型檢測(cè)方法、樣本量、病例組對(duì)照組樣本量等信息。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Stata12.0軟件進(jìn)行Meta分析。效應(yīng)量采用優(yōu)勢(shì)比OR值和95%CI評(píng)估。采用I2(I-squared)評(píng)估異質(zhì)性，若I-squared<50%，則采用固定效應(yīng)模型分析，反之則采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析。采用Begg’s和Egger’s 檢驗(yàn)評(píng)估發(fā)表偏倚。

2結(jié)果

2.1文獻(xiàn)檢索結(jié)果

按照檢索策略，初步篩選36篇文獻(xiàn)，根據(jù)相關(guān)納入及排除標(biāo)準(zhǔn)，剔除綜述或Meta分析12篇，剔除無(wú)唐氏綜合征臨床確診結(jié)論的文獻(xiàn)3篇，剔除檢測(cè)對(duì)象為唐氏患兒本身，而非唐氏患兒母親的文獻(xiàn)3篇，另有11篇文獻(xiàn)出現(xiàn)同一團(tuán)隊(duì)發(fā)表多篇同類研究情況，選取各團(tuán)隊(duì)(共3個(gè))所發(fā)表文獻(xiàn)中研究病例最多、質(zhì)量最高的文獻(xiàn)，剩余8篇文獻(xiàn)予以剔除。最終納入10篇文獻(xiàn)，均為病例對(duì)照研究。其中英文3篇，中文7篇[3-12]。累積病例組657人，對(duì)照組895人，見(jiàn)表1。10篇文獻(xiàn)中，有1篇未進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)[7]，考慮減少發(fā)表偏倚，未予以剔除。

2.2基因型TT+CT vs.CC與子代唐氏綜合征的相關(guān)性

基因型TT+CT vs.CC與子代唐氏綜合征的異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示I-squared=16.0%，故采用固定效應(yīng)模型分析。Meta分析顯示，TT+CT型與CC型在中國(guó)漢族人群子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)方面，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，合并OR及95%CI為2.19(1.73～2.75)，如圖1所示。剔除未提及Hardy-Weinberg平衡的研究后[7]，其合并OR及95%CI為2.15(1.70～2.72)。提示母代MTHFRC677T位點(diǎn)多態(tài)性中，TT+CT型相比較于CC型，是子代發(fā)生唐氏綜合征的危險(xiǎn)因素。

表1 納入研究的基本特征Table 1 Characteristics of the eligible studies included in the meta-analysis

注：RFLP為限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)的基因分型技術(shù)，NA指文獻(xiàn)中無(wú)該數(shù)據(jù)。

圖1 中國(guó)漢族人群母親MTHFR C677T位點(diǎn)TT+CT vs.CC基因型與子代唐氏綜合征發(fā)病的相關(guān)性分析Fig.1 Association between TT+CT genotype vs.CC genotype of MTHFR C677T and the risk of DS in offspring in Chinese Han population

2.3等位基因T vs.C與子代唐氏綜合征的相關(guān)性

等位基因T vs.C與子代唐氏綜合征的異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示I-squared=65.6%，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型分析，以T為暴露因素，C為非暴露因素。Meta分析顯示，等位基因T vs.C與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)方面，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性，合并OR及95%CI為1.82(1.40～2.37)，如圖2所示。在剔除未提及Hardy-Weinberg平衡的研究后[7]，其合并OR及95%CI為1.74(1.34～2.27)，提示母親MTHFRC677T位點(diǎn)多態(tài)性中，等位基因T是子代發(fā)生唐氏綜合征的危險(xiǎn)因素。

2.4發(fā)表偏倚分析

2.4.1中國(guó)漢族人群母親MTHFR C677T位點(diǎn)基因型TT+CT vs.CC與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)表偏倚分析

Begg’s 漏斗圖顯示，納入的10項(xiàng)研究以合并效應(yīng)量OR為中心，大致對(duì)稱分布，呈倒漏斗形，見(jiàn)圖3。進(jìn)一步采用Egger’s test分析顯示，P=0.613，截距95%CI為(-3.120～4.961)，提示納入分析的研究尚未發(fā)現(xiàn)有明確的發(fā)表偏倚，見(jiàn)圖4。

圖3中國(guó)漢族人群母親MTHFRC677T位點(diǎn)TT+CTvs.CC基因型與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)表偏倚分析(Begg’s檢驗(yàn))

Fig.3 Publication bias analysis of association between TT+CT genotype vs.CC genotype of MTHFR C677T and the risk of DS in offspring in Chinese Han population (Begg’s test)

圖4中國(guó)漢族人群母親MTHFRC677T位點(diǎn)TT+CTvs.CC基因型與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)表偏倚分析(Egger’s檢驗(yàn))

Fig.4 Publication bias analysis of association between TT+CT genotype vs.CC genotype of MTHFR C677T and the risk of DS in offspring in Chinese Han population (Egger’stest)

2.4.2中國(guó)漢族人群母親MTHFR C677T位點(diǎn)等位基因T vs.C與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)表偏倚分析

Begg’s 漏斗圖顯示，納入的10項(xiàng)研究以合并效應(yīng)量OR為中心，大致對(duì)稱分布，呈倒漏斗形，見(jiàn)圖5。進(jìn)一步采用Egger’s test分析顯示，P=0.365，截距95%CI為(-3.464～8.412)，提示納入分析的研究尚未發(fā)現(xiàn)有明確的發(fā)表偏倚，見(jiàn)圖6。

圖5中國(guó)漢族人群母親MTHFRC677T位點(diǎn)等位基因Tvs.C與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)表偏倚分析(Begg’s檢驗(yàn))

Fig.5 Publication bias analysis of association between maternal MTHFR C677T T vs.C allele and the risk of DS in Chinese Han population (Begg’s test)

圖6中國(guó)漢族人群母親MTHFRC677T位點(diǎn)等位基因Tvs.C與子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)表偏倚分析(Egger’s檢驗(yàn))

Fig.6 Publication bias analysis of association between maternal MTHFR C677TT vs.C allele and the risk of DS in Chinese Han population (Egger’stest)

3討論

3.1葉酸代謝與MTHFR突變

葉酸是體內(nèi)的一碳單位供體，葉酸代謝途徑可為DNA合成提供一碳單位，還可通過(guò)甲基化過(guò)程提供甲基，維持DNA穩(wěn)定性。亞甲基四氫葉酸還原酶是葉酸代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主要作用是將無(wú)活性的5,10-亞甲基四氫葉酸還原為有活性的5-甲基四氫葉酸，其編碼基因MTHFR的C677T突變可顯著降低該酶的活性，引起葉酸代謝障礙，進(jìn)而導(dǎo)致DNA復(fù)制、DNA甲基化修飾等過(guò)程的紊亂，引發(fā)神經(jīng)管缺陷、癌癥、心腦血管疾病等多種病癥[13]。此外，有研究顯示MTHFR基因C677T突變與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、產(chǎn)婦產(chǎn)后抑郁癥等相關(guān)[14-15]。

3.2 MTHFR與子代唐氏綜合征風(fēng)險(xiǎn)

目前，國(guó)外有多篇Meta分析顯示，MTHFR C677T突變與唐氏綜合征發(fā)病相關(guān)[1,16-20]。其中，Rai等[1]的研究納入34篇文獻(xiàn)報(bào)告，積累3 098例唐氏患兒母親和4 852例正常對(duì)照母親，其分析結(jié)果提示母親MTHFR C677T基因型是子代唐氏綜合征發(fā)生的危險(xiǎn)因素，TT+CT vs.CC,OR及95%CI為1.35(1.13～1.60)。在其Meta分析中，歐美人群與亞洲人群，呈現(xiàn)出并不完全一致的結(jié)果。亞洲人群的OR值較歐洲人群高，美國(guó)人群則居于歐洲與亞洲人群之間，而針對(duì)中國(guó)漢族人群的Meta分析則較少。張福全等[21]對(duì)5篇文獻(xiàn)進(jìn)行Meta分析，積累257例唐氏患兒母親和383例正常母親數(shù)據(jù)，其TT+CT vs.CC合并OR及95%CI為2.28(1.57～3.29)。

本研究聯(lián)合使用多種文獻(xiàn)檢索途徑，對(duì)文獻(xiàn)設(shè)定了較為嚴(yán)格的入組標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格排除了同一研究組(同一作者或同一研究組不同作者)不同文獻(xiàn)的數(shù)據(jù)。共納入10篇文獻(xiàn)，累積病例組657人，對(duì)照組895人。TT+CT vs.CC合并OR及95%CI為2.19(1.73～2.75)，在剔除未提及Hardy-Weinberg平衡的樣本后，其合并OR及95%CI為2.15(1.70～2.72)。等位基因T vs.C合并OR及95%CI為1.82(1.40～2.37)，在剔除未提及Hardy-Weinberg平衡的研究后，其合并OR及95%CI為1.74(1.34，2.27)，提示母親MTHFRC677T位點(diǎn)多態(tài)性與子代發(fā)生唐氏綜合征的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，MTHFR 677 C>T突變，即TT/CT型增加子代唐氏綜合征發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 MTHFR突變與唐氏綜合征相關(guān)性機(jī)制

目前關(guān)于MTHFR C677T突變與唐氏綜合征的相關(guān)性機(jī)制仍未完全明了，DNA甲基化對(duì)于基因組的完整性和染色質(zhì)的穩(wěn)定性至關(guān)重要。有研究表明，低葉酸狀態(tài)可能影響DNA的甲基化，因而增加核酸斷裂的概率，這種不穩(wěn)定性可能會(huì)導(dǎo)致異常染色體分離。另有假說(shuō)提出MTHFR變異體可能抵消了三體導(dǎo)致的胱硫醚-β-合成酶(cystathionine beta synthase，CBS)過(guò)表達(dá)，從而使原本應(yīng)該流產(chǎn)的21三體患兒得以生存，增加了21三體患兒的出生率[16]。

3.4本研究的局限性

由于本研究納入的研究例數(shù)仍較少，且只對(duì)MTHFR C677T突變這一單一因素進(jìn)行Meta分析，未分析環(huán)境等其他影響因素，故對(duì)于更可靠的結(jié)論，有待于更多的大樣本研究。