汪明玉，張立輝，周浩，趙勇

腦小血管?。╟erebral small vessel disease，CSVD）屬于隱襲性腦血管疾病之一，可導致隱匿性卒中、認知功能障礙、癡呆及步態(tài)障礙等臨床疾病和癥狀。近年來，CSVD作為認知障礙的重要病因，越來越受到關注[1]。盡管CSVD是導致人群認知功能下降的一個重要因素，但其確切的發(fā)病機制目前尚不清楚[2]。研究者認為腔隙性梗死灶、微梗死、血管周圍間隙擴張、神經髓鞘脫失、腦動脈硬化、腦淀粉樣血管病變等神經影像學及神經病理學改變都是CSVD認知功能障礙的早期表現，但這些改變都缺乏特異性[3]。因此，探索有效的CSVD早期檢測指標為干預性治療提供機會，是十分必要的。高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy）與CSVD 認知功能障礙的相關性已經得到實驗研究的證實，但是由于影響外周Hcy混雜因素較多，其準確性受到質疑。近年來，已有研究發(fā)現Hcy相關基因MTHFRC677T基因的突變與CSVD的發(fā)病相關[4-5]，而基因檢測可以有效避免各種血管病混雜因素的影響?；诖?，本文就MTHFRC677T基因與CSVD認知功能障礙的相關性進行研究。

1 研究對象與方法

1．1 研究對象 連續(xù)入組2017年12月-2019年3月就診于濰坊市人民醫(yī)院神經內科的門診及住院CSVD患者進行前瞻性研究，CSVD影像學診斷標準參照《中國腦小血管病診治共識》[6]。

入組標準：①年齡50～85歲；②顱腦MRI檢查顯示新發(fā)的小的皮質下腔隙性梗死、可能為血管起源的腔隙、可能為血管起源的腦白質高信號、血管周圍間隙、腦微出血的CSVD患者；③未服用過影響認知功能的藥物；④患者本人或其家屬能配合神經心理學檢查；⑤患者或其家屬簽署知情同意書。

排除標準：①大面積皮質或皮質下梗死者及多發(fā)性硬化、顱內腫瘤等可能引起腦白質高信號者；②嚴重的視力、聽力障礙，嚴重失語或肢體功能障礙而影響檢查者；③由腦血管病以外的其他原因導致的認知障礙（如帕金森病、癲癇、精神病史、甲狀腺功能低下、酒精依賴或藥物濫用等）；④嚴重心臟、肝臟及腎功能不全者；⑤重度癡呆，臨床癡呆評定量表（clinical dementia rating，CDR）為3分者；⑥服用對Hcy代謝有影響的藥物者。本研究獲得濰坊市人民醫(yī)院倫理委員會批準。

1．2 分組 納入研究的CSVD患者認知功能障礙診斷及分級參照蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）評分及CDR評分。根據MoCA評分及CDR評分進行分組。MoCA評分≥26分（CDR評分=0分）者為認知功能正常組；MoCA評分20～25分（CDR評分=0分）者為輕度認知功能障礙組；MoCA評分＜20分（CDR評分=0．5～2分）者為癡呆組。MoCA及CDR量表均由經過神經心理量表培訓的神經內科醫(yī)師完成。

1．3 研究方法

1．3．1 基線資料 記錄所有入組患者的年齡、性別、受教育年限、吸煙（連續(xù)或累積吸煙≥6個月）、飲酒（每月飲酒量＞1．5 kg，連續(xù)1年以上者）、婚姻狀況等資料及高血壓、糖尿病等危險因素[7]。所有入組者清晨空腹采集肘靜脈血，采用羅氏全自動生化分析儀，檢測血清Hcy、TC及TG水平。Hcy≥17 μmol/L，為HHcy。高膽固醇血癥為TC＞6．3 mmol/L，高三酰甘油血癥為TG＞1．82 mmol/L。

1．3．2 磁共振檢查 使用Siemens MAGNETOM Spectra Skyra 3．0T磁共振掃描儀進行頭顱M R I檢查。由2 名接受過神經影像培訓的神內科醫(yī)師評定，意見不一致時會商確定。MRI檢查序列包括：①橫斷面快速梯度回波（fast field echo，FFE）T1WI；②快速自旋回波（turbo spin-echo，TSE）T2WI；③FLAIR T2WI；④增強T2加權血管成像序列（enhanced T2star-weighted angiography，ESWAN）3D梯度回波（gradient echo，GRE）序列。

1．3．3MTHFRC677T基因多態(tài)性檢測 ①樣本的制備：采集空腹靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，ED TA）抗凝管中，并用DNA純化提取試劑盒提取基因組DNA。根據限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技術及Hinf1限制性內切酶片段長度進行MTHFR基因多態(tài)性分析。②PCR擴增：向MTHFR擴增液中加入Taq酶、基因組DNA，混勻，然后進行PCR擴增。③雜交、顯色：將MTHFR基因芯片放入雜交儀片架中，將雜交緩沖液及PCR擴增產物，混勻制成雜交反應液，加入試管中，放入雜交儀運行雜交程序；反應結束后，取出芯片，將芯片放入生物芯片識讀儀中用基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描和數據分析。④基因亞型的判斷：限制性內切酶將C677T 198bp PCR產物酶切后，野生型677CC有198bp片段，雜合突變型677CT有2個基因片段：198bp和175bp，純合突變型677TT產生175bp片段。

1．4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17．0進行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，用表示，整體比較采用方差分析進行檢驗，兩組間比較采用LSD-t檢驗方法。計數資料用率表示，采用χ2檢驗進行分析。血清Hcy水平、MTHFR基因多態(tài)性與CVSD認知功能障礙相關性用Pearson相關檢驗。P＜0．05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 一般資料 研究共納入130例患者，其中男性87例（66．9%）。認知功能正常組63例，輕度認識功能障礙組35例，癡呆組32例。3組CSVD患者在年齡、性別、受教育年限、婚姻狀況等基線資料方面的比較，差異無統(tǒng)計學意義（表1）。3組血清Hcy水平整體差異有統(tǒng)計學（P＜0．001），進一步兩兩比較顯示，癡呆組患者血清Hcy水平高于輕度認知功能障礙組（P＜0．001）和認知功能正常組（P＜0．001），輕度認知功能障礙組Hcy水平高于認知功能正常組（P＜0．001）。

表1 3組腦小血管病患者基線資料的比較

2．2 血清同型半胱氨酸與認知功能障礙的相關性 Pearson相關檢驗顯示血清Hcy水平與認知功能障礙正相關（r=0．626，P＜0．001）。

2．3MTHFRC677T基因多態(tài)性與認知功能障礙的相關性 對認知功能正常組、輕度認知功能障礙組和癡呆組患者基因型進行檢驗發(fā)現，3組基因型分布不同（χ2=19．265，P=0．001）。3組間基因型進行相關分析，MTHFR677 C→T基因突變與CSVD患者認知功能下降程度正相關（r=0．359，P=0．001）（表2）。

對3組患者MTHFRC677T等位基因進行檢驗發(fā)現，認知功能正常組、輕度認知功能障礙組和癡呆組C等位基因頻率分別為72．2%、48．6%、40．6%，T等位基因頻率分別為27．7%、51．4%、59．3%；C等位基因與T等位基因在整體中的分布差異有統(tǒng)計學意義（χ2=23．103，P＜0．001）。3組患者等位基因進行相關性比較，T等位基因頻率與CSVD患者認知功能障礙弱正相關（r=0．273，P＜0．001）。

3 討論

CSVD是指顱內小靜脈、小動脈、毛細血管、微動脈等小血管病變導致的疾病，為涉及臨床、病理及神經影像學改變的一系列綜合征，與卒中及認知功能下降的風險密切相關[8]。CSVD的診斷主要依靠結構性MRI技術，其典型影像學特征包括腦白質高信號、腦微出血、血管周圍間隙、新發(fā)的小的皮質下腔隙性梗死等[9]。年齡、性別、吸煙、高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病等都被證實是CSVD的傳統(tǒng)危險因素。近年來，有研究發(fā)現HHcy主要影響顱內小血管，是CSVD的獨立危險因素[10]。Hcy作為蛋氨酸及半胱氨酸代謝重要的中間產物，其可能造成血管損傷的機制包括：首先，Hcy可能誘導血管內皮細胞基質金屬蛋白酶-2的過度表達，而后者可以通過損傷血管基質而破壞血腦屏障[11-12]；其次，Hcy可誘導活性氧自由基、二甲基精氨酸等物質，抑制血管內皮細胞一氧化氮的分泌，從而進一步損傷內皮細胞結構和功能，引起血管壁重構等一系列改變，最終導致腦深部白質和基底節(jié)區(qū)核團缺血[13-14]。這一系列反應最終導致了CSVD的發(fā)生及發(fā)展。

表2 3組MTHFR基因多態(tài)性的比較

CSVD可導致以執(zhí)行功能、語言、視空間能力、信息處理速度為主的認知功能的下降，且認知功能障礙程度與CSVD評分正相關[15]。作為CSVD的獨立危險因素，已有大量研究證明，HHcy與CSVD的認知功能障礙密切相關，HHcy可引起CSVD各亞型患者認知功能的下降[16]。有大型隊列研究發(fā)現，HHcy與認知功能下降程度正相關[17-18]。有研究發(fā)現，HHcy可引起全腦、海馬及皮層等部位體積縮小，從而認為腦萎縮可能是HHcy導致認知功能下降的中間因素。研究者認為，一方面HHcy通過氧化應激等作用使腦小血管內皮細胞受損、細胞凋亡，最終導致動脈粥樣硬化而引起腦白質變性或隱匿性無癥狀性腦梗死[19]；另一方面HHcy會通過誘導鈣離子超載及大量氧自由基生成等，引起tau蛋白過度磷酸化，使得β-淀粉樣蛋白沉積，進一步加速神經元的凋亡，而這兩者均是認知障礙發(fā)生的重要原因[20]。

MTHFR是Hcy代謝過程中的一個關鍵酶，可以維持生物體內Hcy的正常水平。MTHFR677 C→T基因突變可以導致HHcy[21]，當發(fā)生突變時，MTHFR基因第677位點上胸腺嘧啶（T）取代胞嘧啶（C），導致該基因所編碼的丙氨酸轉變?yōu)槔i氨酸，這一改變降低了MTHFR的活性，酶活性的降低導致了Hcy濃度的升高，最終引起了腦血管病及神經退行性疾病的發(fā)生[22]?；诖?，MTHFRC677T基因多態(tài)性與CSVD的相關性得到了廣泛關注與研究。有研究者對多項大型實驗研究進行了匯總分析，證實MTHFRC677T基因多態(tài)性與CSVD發(fā)病密切相關，且證明TT基因型是CSVD的獨立危險因素[23]。

本研究顯示，CSVD患者中輕度認知功能障礙組與癡呆組患者MTHFRC677T基因突變（TT）基因型和T等位基因頻率均顯著高于對照組，提示MTHFR677基因C→T突變可能是CSVD患者認知功能損害的危險因素。進一步分析顯示T等位基因頻率與認知功能損害程度正相關，提示MTHFRC677T的T等位基因可能是CSVD患者認知功能障礙的危險因素。同時，癡呆組患者Hcy水平顯著高于輕度認知功能障礙組及認知功能正常組，與之前的研究結果是一致的。

既往研究證實，維生素B12及葉酸缺乏可以加重HHcy對認知功能障礙的損害，所以早期發(fā)現和用藥可以預防及減輕其對認知功能障礙的影響。但由于Hcy水平受高血壓、年齡等多種因素影響，所以結果準確性有一定程度的誤差。而本研究中的MTHFRC677T基因水平測定可以避免混雜因素的影響，準確度及靈敏度更高。能更好地預測認知功能損害的易發(fā)人群，給予早期干預，或可預防認知功能障礙的發(fā)生及進展。但本研究未對CSVD各影像學亞型進行詳細分類，因此對于各亞型與MTHFRC677T基因多態(tài)性的相關性未進行深入研究，有待在以后的臨床工作中進一步探討。