陳 鵬 張文斌 王 瑤 焦方舟 王魯文 龔作炯

武漢大學(xué)人民醫(yī)院感染科 (湖北 武漢，430071)

急性肝衰竭是由多種因素引起的肝細(xì)胞大量壞死及炎癥細(xì)胞浸潤而導(dǎo)致的臨床綜合征，以起病急、并發(fā)癥多、病死率高為主要特征，目前尚缺乏有效的預(yù)防和治療措施。肝衰竭患者存在著嚴(yán)重的腸道微生態(tài)失衡，保護(hù)腸黏膜可能成為治療急性肝衰竭的一個策略。有研究報道谷氨酰胺對腸道黏膜屏障具有保護(hù)作用，但該藥對腸道作用的保護(hù)機(jī)制尚未完全闡述清楚[1，2]。本研究探討了谷氨酰胺對急性肝衰竭大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡的影響及其相關(guān)機(jī)制，為急性肝衰竭的治療提供新方法與理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器及試劑 VICTOR3 1420型酶標(biāo)儀購自芬蘭 PerkinElmer 公司；日立自動生化分析儀購自日本Hitachi公司; 電泳儀購自北京六一儀器廠 ；蛋白掃描儀購自德國EPSON公司；BX53型生物顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自Roche Applied Science，DAPI購自武漢碧云天公司，脂多糖(LPS)、D-氨基半乳糖(D-Gal)、L-谷氨酰胺顆粒均購自美國 Sigma Aldrich 公司；BCA蛋白定量檢測試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司；10%中性甲醛購自武漢谷歌生物科技有限公司。

1.2 實驗動物 雄性健康SPF級SD大鼠45只，體質(zhì)量270～290 g，購自武漢大學(xué)動物實驗中心。飼養(yǎng)條件為(25±2)℃，(50±15)%的相對濕度，正常的晝夜節(jié)律(12 h黑暗/12 h光照)。研究方案嚴(yán)格按國際公認(rèn)原則及武漢大學(xué)實驗室動物護(hù)理和使用原則進(jìn)行。

1.3 實驗方法 45只大鼠SD雄性隨機(jī)分為3組，即正常組、模型組、谷氨酰胺組，每組15只。實驗前，所有大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)1周。模型組和谷氨酰胺組大鼠采用腹腔注射D-Gal 400 mg/kg和 LPS 100 μg/kg的方法制備急性肝衰竭模型。谷氨酰胺組大鼠在造模前3 d給予L-谷氨酰胺0.5 g/kg灌胃處理，1次/d，至造模后24 h。正常組和模型組大鼠每天給予生理鹽水灌胃。在造模后 48 h，觀察記錄各組大鼠生存情況，處死大鼠，收集每只大鼠眼靜脈血液約3 ml。 取15 cm左右小腸腸組織，經(jīng)pH 7.4的PBS清洗后，凍存于-80℃冰箱中，以備熒光染色、提取蛋白，其余腸組織標(biāo)本經(jīng)10%的甲醛固定，石蠟包埋，用于HE染色。

1.4 檢測指標(biāo) ①肝功能：全自動生化分析儀檢測3組大鼠外周靜脈血丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT) 、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST) 和總膽紅素(TBil)的水平，操作均嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行。②鏡檢腸組織：分別取各組經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋的小腸組織，把修整好的蠟塊進(jìn)行切片，片厚4μm，將切片依次放入二甲苯、無水乙醇、蒸餾水中清洗。Harris蘇木精染色切片5 min，自來水沖洗后把切片放入伊紅染液中染色2 min。依次將切片放入無水乙醇、二甲苯中脫水至透明，晾干后樹膠封片。光鏡下觀察各組小腸組織病理學(xué)變化。③小腸上皮細(xì)胞凋亡檢測：分別取3組大鼠小腸組織，酒精脫水、浸蠟、包埋、切片和烤片。切片脫蠟后滴加蛋白酶K工作液10～20 μg/ml制備TUNEL反應(yīng)混合液，處理組用50 μl 末端脫氧核酸轉(zhuǎn)移酶(TdT+450 μl熒光素標(biāo)記的dUTP液混勻；而對照組標(biāo)本僅加50 μl 熒光素標(biāo)記的dUTP液，陽性對照組標(biāo)本先加入100 μl DNase I。在15～25 ℃孵育10 min，吸水紙擦干玻片后加50 μl TUNEL反應(yīng)混合液于標(biāo)本上，37 ℃避光孵育60 min，然后用PBS洗滌3次，每次5 min。 滴加DAPI避光孵育5 min，對標(biāo)本進(jìn)行染核，PBST 5 min×4次， 用吸水紙吸干玻片上液體，用封片液封片，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，采集圖像，隨機(jī)選取3個高倍視野(200倍)，觀察陽性細(xì)胞數(shù)，計算其標(biāo)記指數(shù)(各視野陽性細(xì)胞數(shù)/視野所有細(xì)胞)，并計算凋亡指數(shù)(各視野標(biāo)記指數(shù)的平均值)。④腸組織線粒體凋亡蛋白檢測：稱取適量腸組織進(jìn)行勻漿提取總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度。配制12%SDS-PAGE凝膠，每孔加樣50 μg進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜后5%脫脂奶粉37℃搖床封閉1 h；洗膜，孵一抗，4 ℃搖床過夜，洗膜，室溫下?lián)u床孵二抗1h，洗膜，采用Odyssey系統(tǒng)掃膜，分析Bcl-2、Bax及Cyt-c的蛋白相當(dāng)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠生存狀況 正常組15只大鼠全部存活，存活率100%；模型組大鼠死亡8只大鼠，存活7只，存活率46.7%；谷氨酰胺組大鼠死亡4只，存活11只，存活率 73.3%。谷氨酰胺組大鼠的存活率高于模型組，P<0.05。

2.2 實驗結(jié)束時3組大鼠血清ALT、AST和TBil檢測結(jié)果 見表1。

表1 3組大鼠血清肝功能結(jié)果比較

與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.01

2.3 實驗結(jié)束時各組大鼠腸黏膜光鏡觀察結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示正常組大鼠腸黏膜上皮完整，上皮細(xì)胞排列整齊，無細(xì)胞腫脹(見彩插頁圖1a)；模型組大鼠腸黏膜部分上皮細(xì)胞脫落，上皮細(xì)胞明顯腫脹(見彩插頁圖1b)；谷氨酰胺組大鼠腸黏膜萎縮和細(xì)胞腫脹程度均較模型組減輕(見彩插頁圖1c)。

2.4 實驗結(jié)束時小腸上皮細(xì)胞凋亡檢測情況 正常組大鼠小腸黏膜DAPI染色熒光顯微鏡下可見腸黏膜上皮細(xì)胞排列整齊，腸上皮細(xì)胞組成的外周藍(lán)色熒光帶無缺損，Tunel染色可見少量紅染的腸上皮凋亡細(xì)胞；模型組大鼠腸DAPI染色可見腸黏膜上皮細(xì)胞排列錯亂，外周藍(lán)色熒光帶殘缺，Tunel染色可見大量紅染的腸上皮凋亡細(xì)胞；谷氨酰胺組DAPI染色可見腸黏膜上皮細(xì)胞欠整齊，外周藍(lán)色熒光帶可見微小的殘缺，Tunel染色可見少量紅染腸上皮凋亡細(xì)胞；融合圖片提示谷氨酰胺組腸上皮細(xì)胞凋亡較模型組顯著減少，但仍高于正常組。

2.5 各組大鼠小腸上皮細(xì)胞調(diào)亡指數(shù) 見表2。

表2 各組大鼠小腸腸上皮細(xì)胞調(diào)亡指數(shù)比較

與正常組比較，#P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，*P<0.01

2.6 3組大鼠腸組織線粒體凋亡途徑蛋白表達(dá)情況 見圖2。Western blot結(jié)果顯示與正常組相比，模型組大鼠腸組織中Bax、Cyt-c 蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達(dá)較正常組低(P<0.05)，Bcl-2/Bax值較正常組下降；而谷氨酰胺組大鼠Bax、Cyt-c 蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平則顯著高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值較模型組也顯著升高。

圖2 3組大鼠腸組織線粒體調(diào)亡途徑蛋白表達(dá)情況

3 討論

谷氨酸是人體中最豐富的游離氨基酸，體內(nèi)大部分的谷氨酰胺都會在腸道內(nèi)代謝，是腸道細(xì)胞利用的主要營養(yǎng)物質(zhì)，在維持腸道生理和對抗多種腸道疾病的治療中起著重要的作用[3]。在腸道生理中，谷氨酰胺具有促進(jìn)腸細(xì)胞增殖，調(diào)節(jié)緊密連接蛋白，抑制促炎癥信號通路，并在正常和病理條件下保護(hù)細(xì)胞，抵抗細(xì)胞的凋亡[2,4]。在一項谷氨酰胺強化的早期腸內(nèi)營養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，補充谷氨酰胺能夠改善肝移植大鼠腸黏膜的血供，降低腸黏膜丙二醛的產(chǎn)生,有助于腸道正常分泌SIgA，抑制腸黏膜巨噬細(xì)胞NF-κB活性，減少腫瘤壞死因子-α等炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而改善肝移植腸黏膜損傷情況，抑制腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素的移位[5]。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，新生大鼠谷氨酰胺的缺乏則可增加腸上皮細(xì)胞的凋亡[6]。這些研究均表明谷氨酰胺對腸道黏膜具有重要的保護(hù)作用。

線粒體凋亡途徑是細(xì)胞發(fā)生凋亡的一種重要方式，主要由Bcl-2 家族蛋白調(diào)控，包括抑制凋亡的 Bcl-2 家族蛋白(如 Bcl-2 和 Bcl-xL)和促進(jìn)凋亡的 Bcl-2 家族蛋白(如BMF、 Bid、Bax 和 Bak)[7]。在線粒體凋亡途徑中，Bcl-2表達(dá)增加則能夠通過降低線粒體膜的通透性、抑制線粒體去極化及Cyt-C釋放而發(fā)揮抗凋亡作用。Bax則可促進(jìn)Cyt-C釋放，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡作用[8]。Kallweit等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，谷氨酰胺可以預(yù)防腸上皮細(xì)胞在受熱損傷和氧化損傷時細(xì)胞的凋亡，一方面是通過增強保護(hù)性熱休克蛋白的表達(dá)，另一方面是通過降低CC-3(cleaved caspase-3)的表達(dá)來實現(xiàn)。他們認(rèn)為谷氨酰胺并不是直接降低CC-3的表達(dá)而直接發(fā)揮預(yù)防凋亡的作用，可能存在另外的中間體來發(fā)揮抗凋亡作用。而在線粒體凋亡途徑凋亡途徑中，釋放到細(xì)胞質(zhì)的Cytc在dATP存在的條件下通過一系列的級聯(lián)反應(yīng)，最終能激活Caspase-3，引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)，從而誘發(fā)細(xì)胞凋亡[10,11]?；谶@些研究我們推測線粒體凋亡途徑可能參與了腸上皮細(xì)胞的凋亡，急性肝衰竭病程中出現(xiàn)的腸道功能障礙，影響急性肝衰竭的發(fā)生發(fā)展，谷氨酰胺可能通過線粒體凋亡抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，改善腸道功能，而進(jìn)一步減緩急性肝衰竭的進(jìn)展，為谷氨酰胺治療急性肝衰竭提供新的理論依據(jù)。

我們的研究結(jié)果提示，谷氨酰胺可以提高急性肝衰竭大鼠的生存率，可通線粒體凋亡途徑，抑制、減少腸上皮細(xì)胞凋亡，減輕急性肝衰竭過程中腸黏膜的損傷，改善肝功能。目前尚未見谷氨酰胺用于急性肝衰竭臨床治療的報道。已經(jīng)有學(xué)者將谷氨酰胺作為干預(yù)劑改善重度慢性乙型肝炎腸道功能，結(jié)果顯示具有較好的腸道保護(hù)功能，能明顯改善內(nèi)毒素血癥[12]。我們期待有更多的大樣本的臨床研究資料，提供更充足的證據(jù)證明谷氨酰胺在急性肝衰竭中的治療價值。