徐悅青 陳恒玲 林顯光

摘要：指出了秀麗隱桿線蟲是一種有節(jié)律性運動的生物，其中排便行為就是一種簡單的節(jié)律性行為。這種簡單性活動過程的執(zhí)行需要基因和細胞的精確表達和調控。對秀麗隱桿線蟲排便的活動過程的執(zhí)行、周期的產(chǎn)生和調制，以及環(huán)境因素的影響進行了簡單的綜合性闡述。主要是從基因突變體上去分析了它們之間的作用及影響。

關鍵詞：排便;節(jié)律性;線蟲

中圖分類號：Q959.174 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）22-0190-03

1 引言

秀麗隱桿線蟲的學名為Caenorhahditis elegans，簡稱C.elegans。屬于線形動物門、線蟲綱動物。秀麗隱桿線蟲本身和自然狀態(tài)下與人類的關系不大，它生活在世界各地的泥土中，以細菌為食，容易人工養(yǎng)殖，對人、動物和植物沒有危害。秀麗隱桿線蟲非常小，成蟲只有1mm左右，結構簡單、身體透明、易于觀察、繁殖周期短等生物學特征，因此它可以作為模式生物[1]。秀麗隱桿線蟲排便行為是一種生物性馬達作用的結果，也稱排便運動程序（DMP）。它是由外周環(huán)境因素和內在的感覺調控，如溫度、食物和機械刺激等。DMP是由三組不同的收縮肌肉組成。DMP根據(jù)肌肉執(zhí)行的功能過程不同分為三個步驟：第一步是軀干后體壁肌肉收縮過程（pBoc），第二步是軀干前體壁肌收縮過程（aBoc），最后一步是腸肌肉收縮（EMC），將腸內容物的排出體外過程（Exp）。并且DMP具有類似于時鐘的屬性，具有規(guī)律性，周期性。通常排便的周期以時間長度去計算，連續(xù)兩個pBocs之間的時間距離為一個周期。在正常條件下（20℃的溫度），成蟲排便大約56s激活一次[2]。

2 DMP的執(zhí)行

DMP的執(zhí)行具有兩個明顯的特點：步驟性和周期性。因此就會思考這些問題：它是怎樣去執(zhí)行這種周期性并且是怎樣去協(xié)調各個過程的。為了了解這一點，將首先回顧一下它的三步過程，特別關注的是在它們之間作用的信號是由那些基因表達調控的，因此這可能涉及行為協(xié)調的不同方面。

2.1 pBoc突變體

pBoc的這一步是目前研究最少的一步。在目前研究中，只發(fā)現(xiàn)了一個產(chǎn)生特定缺陷的pBoc的基因egl～8，它編碼磷脂酶Cβ的同源物[3]。egl-8突變體也有其他的行為缺陷，如產(chǎn)卵缺陷，這可能與基因產(chǎn)物作用于調節(jié)神經(jīng)肌肉接頭處的乙酞膽堿的釋放有關。從pBoc表型缺陷體中可以看出egl-8是表達在腸細胞中，并且在后腸細胞中表達最強。這個與pBoc的信號直接由后腸發(fā)起相一致，因此cgl-8是協(xié)調DMP實施作用的關鍵基因。

2.2 aBoc突變體

aBoc缺陷突變體分為兩種：一種是只影響aBoc過程的abo突變體，另一種是同時影響aBoc和exp的過程的axe突變體[4]。這些突變體往往具有普遍的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷，經(jīng)常表現(xiàn)運動缺陷。aex-1編碼C2結構區(qū)域蛋白，這種蛋白調節(jié)突觸小泡的釋放[5];aex-3編碼ARab3-GTP酶的鳥嗓嘌呤換因子（GEF），通過在突觸前RAB-3調節(jié)囊泡釋放的作用，并通過不同的途徑作用于新的蛋白CAB-1[6];aex-5編碼一個呋喃類前激素轉化酶?；谶z傳證據(jù)表明，aex-5似乎與aex-1作用相同的途徑。aex-1轉基因表達在腸道中，可以拯救突變體的aex-1的表型。而aex-1轉基因表達在肌肉組織中，可以挽救突變體的其他神經(jīng)傳遞的缺陷。在突變體肌肉中表達aex-5也可以挽救一些aex-5突變體的神經(jīng)傳遞缺陷，但它不能拯救它的表型缺陷。肌肉或腸道中的活性aex-5以一種分泌肽信號去調節(jié)突觸小泡的釋放的，并且aex-1可能也參與到這種作用于腸道的信號通路。

2.3 Exp突變體

已鑒定出大量的Exp突變體。這些突變體可以分為下列四類。

第一類突變體會產(chǎn)生神經(jīng)傳遞的缺陷。其中fat-3編碼D6-去長鏈酶，這種酶是合成長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs）所必需的酶。fat突變體表現(xiàn)exp過程的缺陷。fat-3突變體已被證明與突觸囊泡的耗盡和膽堿能，5-羥色胺能神經(jīng)肌肉接頭的神經(jīng)遞質異常釋放有關[7]，它們同樣可以通過減少GABA能神經(jīng)傳遞來影響腸肌的收縮。

第二類突變體表現(xiàn)出半顯性的Exp。由功能突變獲得表型，如突變體表現(xiàn)出與體壁或咽?。ɑ騼烧撸┫嚓P的額外肌肉缺陷。同時這些突變體也有一些產(chǎn)卵缺陷（EGL）。研究表明這些基因可能是作用于肌肉或者影響肌肉的興奮作用。egl-30可能也屬于這一類，分析表明，雖然egl-30在一些肌肉中表達，但它主要也是在神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在那里它起調節(jié)突觸釋放的作用。目前尚不清楚它的排便表型的作用部位是在肌肉還是在神經(jīng)系統(tǒng)中[8]。

第三類突變體會產(chǎn)生神經(jīng)遞質r-氨基丁酸（GA-BA）有關的缺陷。產(chǎn)生Exp缺失表型的突變體表現(xiàn)出GABA生物合成、轉運或突觸前釋放的異常缺陷，還可能表現(xiàn)出DVB和AVL向GABA能神經(jīng)元的異常分化。雖然在大多數(shù)情況下，GABA是抑制性神經(jīng)遞質，通過激活選擇性陰離子通道介導抑制作用。腸道肌肉缺乏GABA與通過激光消融去除AVL和DVB導致腸道興奮性缺乏的效果是一樣的，表現(xiàn)出GABA在該系統(tǒng)中起興奮性神經(jīng)遞質的作用。

第四類突變體是那些具有腸肌發(fā)育的缺陷的突變體。腸肌是指兩塊腸道肌肉（IM），括約肌和肛門減壓?。ˋD）。它屬于線蟲的小肌肉。例如hlh-8突變體編碼一種進化保守的環(huán)螺旋（BHLH）的轉錄因子，這種轉錄因子在中胚層模式形成中具有進化保守的作用，hlh-8突變體也表現(xiàn)出Exp過程的缺陷。dsc-1突變體具有多層次排便功能缺陷，包括Exp缺陷。編碼配對同源異型核轉錄因子dsc-1的突變體在的AD和IM中表達exp-1，這個恢復exp-1表達可以挽救dsc-1突變體的Exp缺陷[9]，表明dsc-1表型的缺陷可能很大程度上歸因于exp-1表達的喪失。因此dsc-1可能是這些肌肉的終端分化所必須的。因此，篩選具有exp缺陷的突變體可能是一種富有成效的為鑒別這種獨特的肌肉分化所需的基因的有效方法。

3 周期的產(chǎn)生與調制

目前為止所引起的最大的關注點是排便行為的節(jié)律性與細胞內鈣振蕩和下游信號作用關系的研究。合并的遺傳學，鈣成像和生理學研究使它成為一個獨特的強大的Ins（1，4/5）P3依賴性鈣信號在非興奮細胞中調控的分子機制模型。

3.1 腸內鈣瞬變

排便周期，定義為兩個連續(xù)的pBocs之間的時間長度。在腸上皮細胞中它是由Ins（1，4/5）P3相關的鈣的振蕩控制。Dal Santo等人通過將鈣敏感染料FurA-2注射到線蟲完整的后腸，產(chǎn)生的自發(fā)腸內鈣振蕩水平與排便周期的長度的頻率一致，且鈣振蕩水平是在pBoc啟動前的達到腸道的高峰。ins（1，4，5）p3受體是一種定位于內質網(wǎng)由itr-1編碼的鈣釋放通道，鈣振蕩在ins（1，4，5）p3受體功能缺失突變體中減慢甚至消失。相反，itr-1的過表達產(chǎn)生長周期縮短。分析表明，盡管itr-1是在多種細胞類型中表達，但是也通過在腸內細胞表達調節(jié)周期排便。腸內的ins（1，4，5）p3依賴性鈣振蕩不僅控制排便速度，而且也能直接控制后壁肌肉的收縮，還可以通過分泌因子的方式激活控制前壁肌肉和腸肌收縮的神經(jīng)回路。

3.2 Ins（1，4/5）P3調制

盡管itr-1在調節(jié)排便率方面起著關鍵作用，但已有大量的突變株被證明可以調節(jié)排便率。然而，只有少數(shù)這些基因似乎是通過直接作用Ins（1，4/5）P3信號來實現(xiàn)的。Ins（1，4，5）P3是由磷脂酶C（PLC）介導的磷脂酞肌醇（4，5）-二磷酸-PTDIN（4，5）P2水解生成的。秀麗隱桿線蟲有六個plc編碼基因，其中就有兩個基因egl-8（PLCB）和plc-3（PLCG）影響排便周期長度。這些基因無論是RNA干擾還是功能喪失突變，都會導致周期長度增加。周期長度和腸道內明顯的鈣振蕩失常有關?；趯tr-1功能增強突變和ins（1，4，5）p3激酶和磷酸酶（分別由lfe-2和ipp-5編碼）功能喪失突變的上位性分析，似乎就像由plc-3而不是egl-8產(chǎn)生的ins（1.4，5）p3直接調節(jié)itr-1一樣。因此，它egl-8分子仍然是可能的通過其他的分子而不是直接通過Ins（1，4，5）P3在排便循環(huán)中起作用。另一個itr-1的上游調節(jié)因子是vav-1編碼的vav家族的鳥嗦嶺交換因子（GEF）。vav-1突變體導致排便周期不規(guī)則。遺傳上位性分析表明vav-1通過rho/rac GTP酶ced-10、mig-2和rho-1和ppk-1（磷脂酞肌醇4-磷酸5激酶）在腸內調節(jié)ins（1，4，5）p3信號。在其他系統(tǒng)中，vav-1已經(jīng)被證明作用于PLCr的上游，所有這些基因都有可能作用于同一途徑。

3.3 脂質代謝調節(jié)

在腸道中，對脂肪酸延伸酶基因elo-2進行RNA干擾表達，會導致排便周期縮短。這可能是由在突變體中棕櫚酸的積累引起的。elo-1編碼脂肪酸伸長酶的突變體，fat-2和fat-3編碼脂肪酸去飽和酶的突變體，都會導致排便周期延長和不規(guī)則，可能是因為突變體中缺乏特定的長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs）。dsc-4編碼線蟲微粒體甘油三酯轉運蛋白（MTP）的突變體，也導致縮短排便周期長度，這可能是腸道中缺少所需要脂類的分泌[10]。所有這些突變體可能通過改變它們的脂類組成影響腸道細胞的某些特性，可能是影響細胞膜或內膜的結構功能，依次影響INS（1，4/5）P3介導的信號傳導。

3.4 肌肉調節(jié)

dsc-1突變體即表現(xiàn)Exp的缺陷又表現(xiàn)周期長度的改變。與上述其他周期長度突變體相比，dsc-1僅在AD和IM中起作用，而不在腸道中起作用。Exp缺陷似乎僅能部分解釋dsc-1的周期長度縮短的原因。正如已經(jīng)描述過的其他Exp突變體，如unc-43功能獲得性突變體，缺乏腸肌收縮導致腸內食物充盈，最終導致一個有力的腸內容物的排出，形成一個或兩個更長的周期。然而，在dsc-1突變體中兩種缺陷似乎是可分離的，因為拯救了Exp缺陷僅部分挽救周期長度改變。這讓人聯(lián)想到一個flr-4等位基因（ut7）突變體可通過外源性氟釋放拯救Exp缺陷，而不影響周期長度的缺陷[11]。同時dsc-1的過表達與野生型相比，周期長度增加。因此，可能有一種從肌肉到腸的反饋調節(jié)機制，有助于協(xié)調腸內產(chǎn)生的鈣信號和各種肌肉類型的定時收縮。在這種反饋機制中dsc-1可能是肌肉活動所需要的。值得關注的是外源性5-羥色胺加快排便率，但是還沒有明確5-羥色胺對周期長度的影響。

3.5 能量代謝調制

另一組有排便時間缺陷的突變是那些在行為和發(fā)育特征的時間上有普遍缺陷的突變。一些突變體表現(xiàn)出“Clk”表型（包括生物鐘的異常功能），其中包括減慢產(chǎn)蛋、咽泵，排便行為率，胚胎和胚胎的后期發(fā)育，衰老等特征[12]。這些tpk-1，clk-1，isp-1突變體影響能量代謝。tpk-1編碼硫胺素焦磷酸激酶（TPK）這是一種硫胺素（維生素B1）轉化成具有生物活性硫胺素焦磷酸（TPP）所必需的酶，其中TPP是大量的生物合成和代謝酶必不可少的輔助因子。clk-1編碼泛醌生物合成所需的羥化酶（UQ，也稱輔酶Q，COQ），泛醌是一種與細胞內氧化還原反應有關的預先酞化泛釀脂類，最重要的是作為線粒體呼吸鏈中電子的轉運體。isp-1編碼線粒體呼吸鏈復合體Ⅲ的rieske硫鐵蛋白。目前還不清楚突變體它們各自功能的中斷導致Clk表型，猜測可能與這些突變體影響能量代謝有關。

4 循環(huán)的環(huán)境調節(jié)

4.1 溫度的調節(jié)

在大多數(shù)情況下，線蟲的所有生理速率都是溫度依賴性，也包括排便率。野生型個體在20℃生長當轉移到15℃時，周期長度顯著增加，當轉移動到25℃時，周期長度顯著降低。這種調整發(fā)生得很快，當野生型線蟲在被轉移到25℃，周期長度在記錄幾個小時后變短。因此，排便周期似乎沒有溫度補償，與其他一些不受溫度的影響的生物節(jié)律不同。然而，有一些突變體揭示了溫度補償機制在該系統(tǒng)中起作用。當clk-1突變體從20℃轉移時到25℃或從20℃到15℃時，周期長度沒有變化。這些突變體揭示了存在溫度對排便周期影響的機制。

4.2 食物的調節(jié)

已經(jīng)有實驗證明，除了溫度之外，食物也調節(jié)周期長度。當食物（大腸桿菌）濃度降低時，周期長度會增加。在完全沒有食物的情況下DMP很少被激活。然而，咽泵率和排便率之間似乎沒有直接關系，這表明食物對循環(huán)長度的影響可能不是反饋的結果。從腸擴張的程度來看，反而可能是感覺輸入所致。鈣/鈣調素依賴的絲氨酸/蘇氨酸激酶Ⅱ型（camk Ⅱ）似乎參與了這種感覺輸入過程，因為unc-43編碼c.elegans camkⅡ）的功能缺失突變體在缺乏食物的情況下繼續(xù)激活該感覺輸入程序[3]。有趣的是，外源性5-輕色胺增加了排便率也會增加咽部的泵送速度這可能是食物對周期長度的影響由5-羥色胺介導。

5 結語

對排便行為的認識目前還不是很清楚。但是秀麗隱桿線蟲的排便行為的機制逐步被發(fā)現(xiàn)。從排便行為的結構分析到排便過程的解析，以及過程中神經(jīng)（AVL和DVB），肌肉、遞質、神經(jīng)肽等的相互作用關系正一步一步被發(fā)現(xiàn)。因此這種節(jié)律性排便行為可以作為一個系統(tǒng)來研究基因功能和解決有關節(jié)律性行為和排便機制的基本問題。對神經(jīng)系統(tǒng)功能、肌肉的基礎發(fā)育，非興奮性細胞中的鈣信號的認識，是認識生命活動的基礎。秀麗隱桿線蟲的排便可以作為一個生物模型，用于研究人類便秘的機制，也可以作為生物節(jié)律性的生物模型，研究人類的生物節(jié)律性如晝夜節(jié)律。上面提到的眾多的研究中，發(fā)現(xiàn)了排便缺陷突變體的多樣性，即使在這樣簡單的系統(tǒng)，也需要許多不同的細胞和整體共同協(xié)調同一個過程。在秀麗隱桿線蟲排便中盡管取得了一些進步，但仍存在許多問題。對于廣泛的排便基因表達，準確識別他們在哪里，他們在排便中所扮演的角色將幫助我們了解各種組織和分子反饋機制。許多突變體都有被證明有周期長度缺陷，但很少有電生理實驗進一步去驗證。因此，無論起點是鈣振蕩、肌肉興奮性、GABA神經(jīng)遞質傳遞、能量代謝或溫度補償，都是揭示動物行為表達所必需的所有因素的過程。

參考文獻：

[1]Reppert S M，Weaver D R.Coordination of circadian timing inmammals[J].Nature，2002（4）：418，935～941.

[2]Liu D W，Thomas J H.Regulation of a periodic motorprogram inC.elegans[J].1.Neurosci，1994（14）：1953～1962.

[3]Lackner M R.Facilitation of synaptic transmission byEGl～30Gqalpha and EGI-8 PLCbeta：DAG binding to UNC-13 is-required to stimulate acetylcholine release[J].Neuron，1999（24）：335～346.

[4]Thomas J H.Genetic analysis of defecation in Caenorhabditisele-gans[J].Genetics，1990（124）：855～872.

[5]Doi M，Iwasaki K.Regulation of retrograde signaling atneuro-muscular junctions by the novel C2 domain protein AEX-1[J].Neuron，2002（33）：249～259.

[6]lwasaki K.aex-3 encodes a novel regulator of presynapticactivityin C.elegans[J].Neuron，1997（18）：613～622.

[7]Lesa G M.Long chain polyunsaturated fatty acids arerequired forefficient neurotransmission in C.elegans.J[J].Cell Sci，2003（116）：4965～4975.

[8]Bastiani C A.Caenorhabditis elegans Galphaq regulatesegg-lay-ingbehavior via a PI.Cbeta-independent and serotonindependentsignaling pathway and likely functions both in thenervous systemand in muscle[J].Genetics，2003（165）：1805～1822.

[9]Branicky R，Hekimi S.Specification of muscleneurotransmittersensitivity by a Paired-like homeodomain proteinin Caenorhabdi-tis elegans[J].Development，2005（132）：4999～5009.

[10]Shibata Y.Redox regulation of germline and vulvaldevelopmentin Caenorhabditis elegans[J].Science，2003（302）：1779～1782.

[11]Take-uchi M.FLR-4，a novel serine/threonine proteinkinase，regulates defecation rhythm in Caenorhabditis elegans[J].Mol.Biol.Cell，2005（16）：1355～1365.

[12]Hekimi S.Viable maternal-effect mutations that affect thedevel-opment of the nematode Caenorhabditis elegans[J].Genetics，1995（141）：1351～1364.

收稿日期：2019-09-29

基金項目：中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金項目（編號：CZP17069;CZY18029）

作者簡介：徐悅青（1992-），女，碩士研究生，研究方向為生物醫(yī)學工程學。

通訊作者：林顯光（1980-），男，副教授，博士，研究方向為神經(jīng)生物學。