馬文艷 潘忠成 王衛(wèi)富 翁婧 李蒲民

摘要：主要研究了沉淀法分離提取發(fā)酵液中多粘菌素E（Colistin sulfate）的生產(chǎn)工藝。對(duì)超濾液熱絮凝、吸附脫色、堿性沉淀以及濃縮液二次脫色等工藝參數(shù)進(jìn)行了考察，結(jié)果表明：工藝最佳條件：超濾液90～95℃熱絮凝5min后，板換快速冷卻，復(fù)合脫色處理：加碳量0.1%、亞硫酸鹽0.5%～1.0%，沉淀?xiàng)l件：pH值為11.0～12.5、15～30℃、靜置1h，濃縮液脫色添加0.4%～0.8%活性炭，處理0.5h，最高收率達(dá)到90%以上，成品各項(xiàng)指標(biāo)符合EP生產(chǎn)標(biāo)準(zhǔn)。通過連續(xù)穩(wěn)定性試驗(yàn)對(duì)各個(gè)參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，得到了適用于工業(yè)化生產(chǎn)的多粘菌素E分離工藝。

關(guān)鍵詞：硫酸粘桿菌素;沉淀分離法;堿性多膚;絮凝

中圖分類號(hào)：TQ923 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1674-9944（2019）22-0186-04

1 引言

多粘菌素E是一種堿性多肽類抗生素，獸用硫酸粘菌素商品為其硫酸鹽。目前生產(chǎn)中主要是連續(xù)樹脂法分離提取[1，3]，但此法污水量大，工藝復(fù)雜，收率低。文獻(xiàn)報(bào)道中的對(duì)多粘菌素E分離技術(shù)較多[2，4，5]，但都不能形成可行性的生產(chǎn)工藝?；钚蕴渴且环N傳統(tǒng)的脫色劑，其生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單，可操作性強(qiáng)，效率高，是抗生素生產(chǎn)提取工藝常見脫色方法。沉淀法分離抗生素是一種傳統(tǒng)方法，具有操作簡(jiǎn)單，但由于多粘菌素的堿性不穩(wěn)定性[5，6]，收率不穩(wěn)定，尚無(wú)利用此法的生產(chǎn)報(bào)道。作者在前期研究在堿性沉淀法[8]上做了大量基礎(chǔ)工作，本文通過對(duì)利用傳統(tǒng)的活性炭預(yù)處理和堿性沉淀法分離多粘菌素E進(jìn)行研究，優(yōu)化各項(xiàng)工藝操作參數(shù)，并與膜分離[2]等工藝結(jié)合，獲得了能夠替代樹脂法的多粘菌素E生產(chǎn)工藝。

2 材料與方法

2.1 材料

多粘菌素E標(biāo)品（BR）由天津施瑞克公司提供，硫酸及硫酸鹽等其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，活性炭為福建大林森木質(zhì)活性炭。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）多粘菌素E測(cè)定高效液相色譜法（HPLC），文獻(xiàn)[9]改進(jìn)方法。

（2）蛋白相對(duì)含量測(cè)定方法采用紫外分光光度計(jì)，設(shè)定波長(zhǎng)280nm，物料稀釋50～100倍測(cè)定吸光值。

（3）色素相對(duì)含量測(cè)定方法采用可見分光光度計(jì)，設(shè)定波長(zhǎng)400nm測(cè)定吸光值。

3 結(jié)果與分析

3.1 多粘菌素E超濾液預(yù)處理

3.1.1 熱處理

對(duì)超濾液進(jìn)行熱處理（結(jié)果見圖1），試驗(yàn)過程中，加熱溫度80℃以上時(shí)，蛋白絮凝量逐漸增多，色素量降低，當(dāng)溫度高于90℃左右出現(xiàn)拐點(diǎn)，色素去除率下降，蛋白去除率升高減緩，同時(shí)降解率快速升高。

結(jié)果表明：溫度在90℃左右最佳，可除去較多的雜質(zhì)，收率保持在95%以上，褐變反應(yīng)加快。因此，熱處理過程應(yīng)快速升溫及降溫，盡量縮短溫度對(duì)效價(jià)和褐變反應(yīng)的影響。

3.1.2 脫色處理

陶瓷清液90～95℃熱處理，活性炭和還原劑復(fù)合影響效果明顯（圖2），色素去除率與還原劑量呈正相關(guān)，蛋白去除率與之無(wú)關(guān)，當(dāng)還原劑量超過1%，對(duì)收率產(chǎn)生負(fù)影響。結(jié)果表明，亞硫酸鹽對(duì)褐變反應(yīng)速率抑制及還原性脫色有較好影響，但過量鹽加入，可能影響多粘菌素E的電荷狀態(tài)或構(gòu)象，穩(wěn)定性降低導(dǎo)致降解發(fā)生。

活性炭對(duì)熱處理后濾液的脫色效果（圖3），活性炭加入量和雜質(zhì)去除率、效價(jià)損失率呈正相關(guān)。結(jié)果表明：較少的活性炭對(duì)效價(jià)也有明顯的影響，但其脫色及去蛋白效果又很顯著，因此保證收率的前提下0.1%的炭量處理為最佳。

3.2 多粘菌素E堿性沉淀過程

3.2.1 不同條件對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性的影響

前期的試驗(yàn)數(shù)據(jù)和藥典記錄一致，堿性條件下，尤其是溶液或濕晶體狀態(tài)下，硫酸粘桿菌素降解受pH值、溫度、時(shí)間等因素影響明顯。

堿性pH值條件下，多粘菌素E的穩(wěn)定性較差，沉淀絮凝和降解反應(yīng)同時(shí)發(fā)生。pH值和溫度對(duì)穩(wěn)定性的影響（見圖4，圖5），結(jié)果表明：pH值低于11.5的時(shí)理論降解率反而更高，pH值在11.5～12.0，沉降過程的理論降解率較低。結(jié)果說明，pH值和溫度都偏低時(shí)，多粘菌素E多呈溶解短膚，更易降解;而pH值和溫度過高，直接導(dǎo)致堿性降解反應(yīng)速率加快。

這與試驗(yàn)過程觀測(cè)到的情況一致，條件前期多粘菌素的形成絮凝速率和降解率呈負(fù)相關(guān)，而調(diào)堿后期，尤其是較高溫度，絮凝沉淀快速形成，降解率反而降低。多粘菌素E呈游離短肽時(shí)，更易降解，降解量的累計(jì)和時(shí)間呈正相關(guān)（圖6）。結(jié)果表明：在試驗(yàn)過程，調(diào)堿操作時(shí)間越短，降解率越低，0.5～1h的生產(chǎn)操作時(shí)間可以降理論降解率控制在10%以內(nèi)。

3.2.2 不同條件對(duì)多粘菌素E沉淀收率的影響

pH值和溫度對(duì)沉降收率的影響（見圖7，圖8），結(jié)果表明：pH值在11.5左右，溫度在25℃左右，沉降收率分別達(dá)到最高。

沉降時(shí)間對(duì)收率的影響（見圖9），結(jié)果表明：沉降時(shí)間在1h左右，收率達(dá)到最高85%～86%。而在保護(hù)劑的作用下（見圖10），0.1%～0.2%的還原性保護(hù)劑可以和環(huán)境中的氧化性基團(tuán)作用，提高活性短肽的惰性，收率提高到88%～89%。

3.2.3 不同條件對(duì)多粘菌素E濃縮液脫色處理效果的影響

超濾液在pH值為4.0時(shí)，不同活性炭量的脫色結(jié)果（見圖11），色素的去除率同活性炭量呈正相關(guān)，少量活性炭對(duì)色素的吸附效率較高，過量加入活性炭的色素吸附效率明顯下降;脫色時(shí)間的色素去除率的影響較小，但炭加入過多，脫色時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)效價(jià)損失影響明顯，脫色時(shí)間控制在0.5h左右最適。

采用0.6%活性炭脫色，考察pH值對(duì)活性炭的脫色效果影響（見圖11）。結(jié)果表明：相對(duì)較高的pH有利于色素的去除，但效價(jià)損失率也較高。結(jié)果可見，pH值為4.0左右色素去除率較高，同時(shí)效價(jià)損失率明顯降低。

氧化劑脫色與活性炭的復(fù)合脫色作用結(jié)果（圖12），復(fù)合處理比活性炭單獨(dú)處理色素去除率提高15%左右，氧化劑與有機(jī)物活性基團(tuán)的反應(yīng)能力較強(qiáng)，極易對(duì)效價(jià)產(chǎn)生影響，使用量不宜過多。

不同活性炭量對(duì)復(fù)合脫色效果的影響（見圖13），結(jié)果表明，活性炭量對(duì)復(fù)合處理色素去除率影響較小，但對(duì)效價(jià)損失影響較大。

不同濃度濃縮液對(duì)復(fù)合處理的脫色影響（見圖14），結(jié)果表明，濃縮液效價(jià)在400～800萬(wàn)單位之間，效價(jià)高低和脫色效果呈負(fù)相關(guān)。這說明高效價(jià)濃縮液粘度較大，脫色過程色素與活性炭的表面接觸幾率降低，同時(shí)多粘菌素E被活性炭吸附后，活性炭的吸附能力進(jìn)一步降低。

3.3 工藝穩(wěn)定性試驗(yàn)

采用以上試驗(yàn)最佳結(jié)果進(jìn)行多批試驗(yàn)，同時(shí)對(duì)脫色后濃縮液進(jìn)行高溫噴干形成成品。對(duì)試驗(yàn)各步收率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及成品各項(xiàng)指標(biāo)結(jié)果（見表1，表2）。

連續(xù)進(jìn)行多批工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證，總收率收率和干粉指標(biāo)都達(dá)到預(yù)期目標(biāo)，工藝各階段質(zhì)量控制穩(wěn)定。

4 結(jié)論

（1）工藝最佳條件：超濾液90～95℃熱絮凝5～10min后，冷卻過濾，一次脫色加碳量0.1%、亞硫酸鹽0.5%～1.0%，沉淀?xiàng)l件pH值為11.0～12.5、15～25℃、靜置1h，濃縮液添加0.4%～0.8%活性炭脫色0.5～1h，最高收率達(dá)到90%以上。

（2）少量的亞硫酸鹽類保護(hù)劑和活性炭的復(fù)合處理效果明顯，但生產(chǎn)應(yīng)用還有待進(jìn)一步生產(chǎn)驗(yàn)證。

（3）脫色后噴干成品各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到EP標(biāo)準(zhǔn)，通過試驗(yàn)連續(xù)驗(yàn)證，該工藝流程簡(jiǎn)單，完全可以達(dá)到生產(chǎn)要求。

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收稿日期：2019-10-09

基金項(xiàng)目：陜西省科技項(xiàng)目（編號(hào)：2018ZKC-173;2019-PT-15）;渭南市科技局項(xiàng)目（編號(hào)：ZDYF-SFGG-17-ZSG）

作者簡(jiǎn)介：馬文艷（1981-），女，碩士，主要從事應(yīng)用微生物及生物醫(yī)藥方面的工作。

通訊作者：潘忠成（1974-），男，博士，主要從事應(yīng)用微生物及生物醫(yī)藥方面的工作。